发布时间：2022-05-09 05:50:35
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摘要：本文对固定化微生物和游离菌净化SO2的性能进行了初步对比实验研究，分别测试了固定化微生物与游离菌在液相和气相环境中对SO2的净化性能，同时考察了在气相条件下二者对SO2的净化效果。实验表明，利用复合固定化方法即吸附—包埋—交联法制备的固定化小球，与游离菌相比，对SO2的净化性能有显著提高。
关键词：固定化微生物 二氧化硫 降解
0 引 言
我国是以煤为主要能源的国家。1990年煤在一次能源中占76.2%，2000年占70%，预计2050年仍占60~70%[1]，这表明我国以煤为主要能源结构在今后相当长时期内不会改变。
我国煤炭大多数都直接燃烧，因此造成烟尘和SO2等污染物大量排放到环境中，导致我国城市的空气污染十分严重。造成了严重的酸雨污染和生态损害。根据有关研究，1995年我国由于酸雨和SO2污染造成农作物、森林和人体健康等方面的经济损失为1100多亿，已接近当年国民生产总值到2.0%[2]。如不严格控制，SO2问题将成为制约我国国民经济发展和社会发展的重要因素，因此，削减和控制燃煤SO2污染是我国能源和环境保护面临的严峻挑战。
早在50年代，Leathan等（1953年）及Temple等（1954年）就分别发现某些化能自养型细菌与煤中FeS2的氧化有关，并从煤矿废水中分离出氧化亚铁硫杆菌（Thiobacilus ferroxidans）[3]。然而，当时，此发现并未引起足够的重视，直至70年代，因世界范围的大气污染和酸雨问题日益严重，世界各国才开始重视与煤炭脱硫有关的微生物研究。
微生物脱硫是利用化能自养微生物对SOX的代谢过程，将烟道气中的硫氧化物脱除。在生物脱硫过程中，氧化态的污染物如SO2，硫酸盐、亚硫酸盐及硫代硫酸盐经微生物还原作用生成单质硫去除[4]。目前，传统的生化处理存在着生物浓度低，会产生大量的污泥，并且给后处理带来麻烦，同时占地面积大，投资高、动力消耗多等问题。这些问题采用传统方法不能解决，而固定化微生技术却展现了广阔的前景[5-6]
固定化微生物技术即固定化细胞技术，是20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术 ，它是通过化学的或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用[7]。固定化微生物技术最初主要用于发酵生产，70年代后期，被用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点。固定化生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的弊端，具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少、产物易分离、反应过程易控制等优点，是一种很有前途的污染物处理技术[8-10]。采用固定化技术可以使微生物封闭在载体内，减少菌体的脱落，同时微生物在载体内可以繁殖，当酶失去活性后，通过培养可恢复其活性而被反复利用[11]。
近年来，随着世界经济的发展及工业的进步，环境问题已成为全球性问题，固定化微生物技术作为一种新的处理方法，已成为生物工程和环境工程技术的一个重要分支，越来越受到人们的重视。固定化微生物法净化低浓度烟气SO2技术的研究不仅拓展了生物技术在废气治理领域的研究与应用，而且为低浓度烟气SO2的生物治理提供了一个新途径。因此本研究对固定化微生物与游离菌净化SO2的性能的进行了对比，以确认固定化微生物法净化SO2的可行性。
1 实验条件与方法
1.1菌种培养实验装置
本驯化实验中所使用的菌种溶液为某污水处理厂氧化沟中段的污水，采用诱导驯化方式对菌种进行驯化，即向菌液中每日通入一定量的SO2气体，并不断地提高SO2气体的量，使微生物逐步适应并经多代繁衍。经过一定时间的驯化后，分析菌种对液相中亚硫酸根的降解性能，来判断菌种对SO2的净化性能。实验装置如图1所示。
Fig.1 experimental equipment of training microbe
图中1、2、3为SO2气体发生装置，即H2SO4溶液和Na2SO3溶液在3中反应生成SO2气体，并在风机的作用下，将气体吹入装有菌液的驯化装置6。
1.2固定化微生物制备方法
常用的固定化制备方法可分为三种：吸附法、交联法和包埋法[12]。现分述如下：
1)吸附法
吸附法是通过静电吸引或利用载体对细胞的亲和性将细胞直接吸附在水不溶性载体上。一般只要把载体放在细胞悬浮液中搅拌或浸泡，然后洗去没有被吸附的游离细胞，就制成了固定化细胞。该法操作简单，对细胞活性影响小，但所能固定的细胞数量有限。吸附法分为物理吸附和离子吸附两种。
2)交联法
交联法不使用载体，是利用双功能或多功能试剂直接与细胞表面的基团如氨基、烃基等进行交联，使细胞之间相互接成网状结构。最常用的交联剂有戊二醛，顺丁烯二酸酐、甲苯二异氰酸酯等。此法化学反应激烈，对细胞活性影响大。另外，交联剂大多价格昂贵，限制了它的广泛应用。
3)包埋法
包埋法是将细胞包裹在凝胶的网格结构中或者包裹在半透性聚合薄膜内，小分子的底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去。包埋的载体主要有聚丙烯酰胺、琼脂、明胶、K—卡拉胶和海藻酸钙等。包埋法的优点在于包埋方法简单、条件温和，可以保持较高的细胞酶活力，是应用最为广泛的细胞固定化方法之一[12]。
根据本课题组的前期实验，增加活性炭的投加量，可使固定化微生物小球的活性和耐酸性均有不同程度的提高，但机械强度基本不变。增加己二胺的投加量，使小球的相对活性、机械强度和耐酸性均有不同程度的增加；交联时间增加也会使小球的机械强度增强。通过本研究前期正交实验确定的固定化小球最佳制备工艺，来制备固定化微生物。
本课题的前期实验研究，分别选用三种复合固定化方法中的最佳条件和包埋法最佳固定条件，制备固定化微生物小球，其性能比较结果如表1所示[13]。
固定方法性能指标 海藻酸钠包埋法 吸附—包埋复合固定法 包埋—交联复合固定法 吸附—包埋—交联法 相对活性% 225.6 261.9 221.3 246.2 机械强度g 27 27 40 42 72h失重率% 36.3 31.7 36.0 28
该结果证明采用复合固定方法即吸附—交联—包埋复合固定法制备固定化小球，不仅保证了固定化微生物很高的相对活性，而且还提高了固定化小球的机械强度及耐酸性。因此本研究采用复合固定方法即吸附—交联—包埋复合固定法，以如图2所示的工艺流程来制备固定化微生物。
图2 固定化微生物制备工艺流程图
Fig.2 Flow chart of making immobilized microbial biomass
1.3固定床反应器
以实验室制备的含SO2气体为处理对象，将固定化微生物小球填充在固定床内，对其中的SO2气体行生化处理，其整套净化实验装置流程如图3所示。
整个流程包括SO2气体的发生系统和净化SO2气体的固定床生化反应器二个部分。实验中，SO2气体是通过Na2SO3溶液1和稀H2SO4溶液2在SO2气体发生器3内反应制得的，并利用风机4将发生器内所生成的SO2气体由底部直接吹入固定床生化反应器。循环液体由高位槽7进入6内并从顶部向下喷淋到固定化微生物小球上（喷淋液体的主要作用是润湿固定化微生物小球，向微生物提供生长所需要的氮磷等营养物，同时将微生物的代谢产物带走），而后由反应器底部排入循环水槽8，再由耐酸泵9打回到高位槽循环使用。SO2气体在塔内上升的过程中与固定化微生物接触而被吸收，净化后的气体由反应器顶部排出。为了避免造成污染，在尾气排空前设置了SO2尾气吸收瓶10。
1.4实验分析方法
气相中SO2和液相中SO32-的分析方法采用碘量法。用奥立龙818型精密酸度计测液相pH值。
2实验结果与讨论
2.1在液相环境中净化SO2能力随时间的变化比较
将一定浓度的SO32-溶液中分别加入含有等量微生物的固定化微生物和游离菌，每隔一段时间测定溶液中SO32-浓度，并计算出净化效率。如图4所示，曝气量为0.1m3/h时，固定化小球的净化速率大于游离菌的，在反应开始进行的20分钟内，固定化小球的净化速率是增大的，游离菌的基本不变；20min以后，二者的净化速率都呈下降趋势。在生化反应的有效时间内，固定化小球的净化速率高于游离菌的。这表明固定化微生物净化SO2的性能优于游离菌的性能。
2.2 在不同pH值的液相环境下对SO2净化性能的比较
因为SO2为酸性气体，所以只研究在偏酸性环境下固定化微生物和游离菌对SO2的净化效率。选择从pH=3到pH=6四个pH值作为实验点，用NaOH溶液和盐酸溶液来调节其液相环境的pH值，考虑到NaOH溶液会消耗SO2，因此将pH值调节好后液相中SO32-的浓度作为SO2的初始浓度，测试游离菌与固定化微生物净化SO2的效率，实验结果如图5所示。
图5显示固定化小球的净化效率明显高于游离菌的，pH=5时固定化小球的净化效率高达70%，而游离菌的只有30%。这也表明固定化微生物对SO2的净化性能优于游离菌的净化性能。
Fig.4 Changing of purification velocity with increasing of time
Fig.5 Effect of pH on purification efficiency
2.3 固定化微生物与游离菌净化SO2气体的性能对比研究
将固定化小球装入如图3所示的固定床6中，制得的SO2气体由风机吹入反应器6，在G处测入口浓度，在改变入口浓度的条件下测固定化微生物的净化效率。在相同的条件下将SO2气体通入菌液中，在相同的时刻测菌液中SO32-浓度和出口SO2浓度，计算出其净化效率，结果如图6所示。当入口浓度为5.1 g/m3时，固定化微生物和游离菌的净化效率都为98%。但随着入口SO2气体浓度的增大，游离菌的净化效率急剧下降。当入口气体浓度为7.2g/m3时，游离菌的净化效率只有40.7%，而固定化微生物的净化效率仍保持在80%以上。二者的净化效率都随着入口浓度的增大而降低，其原因主要是当入口浓度较低时，微生物可以和SO2气体充分接触，进而被生化吸收。随着入口SO2浓度的增加，多余的SO2在较短的时间内未能被微生物吸收净化，而是随着气相主体排出。因此就出现了随着入口SO2浓度的增加其净化效率反而下降的现象。
但是，如图6所示，固定化小球的SO2净化效率高于游离菌的。其原因主要是因为采用的是好氧微生物，固定化微生物可以与气相接触，即可耗用连续相的气相中的氧来对SO2进行生化吸收，而游离菌主要耗用的是液相中数量有限的溶解氧。因此富氧的反应气氛是固定化微生物净化效果优于游离菌净化效果的一个重要原因。
3结论
本研究对固定化微生物与游离菌净化SO2的对比实验结果表明，经固定化后的微生物在液相和气相环境中均对SO2有较强的净化去除作用，其净化性能明显优于游离菌的净化性能，因此有继续开展深入研究的价值和必要。
论文关键词:产酸发酵反应器 生态因子 顶极群落 生态演替 生态位
论文摘要:通过产酸发酵反应器的动态试验,考察生态因子(pH、ORP)等制约的不同发酵类型顶极群落的结构、优势种群的组成和生态演替的规律,阐明不同发酵类型代谢及其顶极群落的典型特征,揭示产酸发酵过程中顶极群落内平衡与反馈调节的生理代谢机制,并以pH值、ORP来表征生态演替过程中优势种群的生态位图。
Ghosh和Poland在1971年提出了利用相分离的原理:分别控制适应于产酸发酵菌和产甲烷菌的最佳生理及生态条件,从而形成具有较高运行稳定性和处理效率的两相厌氧生物处理系统。目前,对于两相厌氧生物处理的微生物生态学的研究普遍受到重视,但是由于产甲烷菌具有种类少、生长繁殖慢、利用底物种类有限、对环境条件敏感等特性,使得人们长久以来认为产甲烷相是两相厌氧处理系统中的关键“限速步骤”,因此大多数研究集中于产甲烷相微生物的生态学研究上。事实上产酸相不同生态条件下形成的末端发酵产物作为产甲烷细菌利用的底物,对产甲烷相乃至整个工艺的稳定运行具有至关重要的作用[1]。以往的研究表明,产甲烷相微生物对底物的转化速率依次为乙醇>戊酸>丁酸>乙酸>丙酸,而乙酸的转化是系统产甲烷即去除效率的“限速步骤”。从整个系统角度出发,产酸相最佳发酵类型应为乙醇型发酵[2]。因此利用连续流产酸发酵反应器,通过对限制性因子(pH、ORP)的调控,考察在人工创建生境中,微生物所遵循的群落与种群生态学演替规律,不同发酵类型的顶级群落内平衡与反馈调节的生理代谢机制,得出以pH、ORP表征的生态演替过程中优势种群的三维实现生态位,这对于进一步阐明产酸相不同发酵类型的生态学规律,提高两相厌氧的整体处理水平具有新的思路和理论指导意义。
1 试验材料与方法
1.1 实验装置
采用沉淀区和反应区一体化、内设气—液—固三相分离装置的连续流搅拌槽式厌氧反应器(CSTR)作为产酸相反应器,有效容积为3.1L,通过对pH、ORP进行调控进行平行实验;反应器外部缠绕电热丝结合温控仪保证内部温度(30±1℃)的厌氧条件,实验中控制COD负荷为8kg/m3·d,进水COD浓度为4000mg/L。具体流程见图1所示。
1.2 实验底物与分析方法
采用废糖蜜为底物,并按照COD∶N∶P=800~1000∶5∶1配以少量N、P。采用标准方法分析测定COD、pH、ORP(以电极电位Eh计,mV)。液相发酵产物采用SC-7气相色谱分析仪,按照任南琪[1](1994)建立的检测方法进行分析。厌氧细菌的培养采用改进的Hungate技术,鉴定方法参见参考文献[3]。
2 结果与讨论
产酸发酵类型指依据酸性末端产物中挥发性脂肪酸(VFA)的分布判断微生物的生理代谢途径。酸性末端产物中始终占据主导地位的物质定义为相应的代谢类型,并将产酸发酵生态系统达到稳态时代谢的优势种群定义为顶极群落。产酸相的三种发酵类型中,丁酸型发酵和丙酸型发酵分别以丁酸或丙酸为主要液相末端发酵产物,而乙醇型发酵的主要液相末端产物为乙醇和乙酸。
生态演替是生物群落的一个动态变化特性,具有定向性、可调控性、趋于稳定性。由于环境因素(因变因子:pH、ORP)、微生物内部群落及末端代谢产物组成的协调控制,产酸相微生物群落在随环境因素定向演替的同时,由于群落的内平衡和反馈调节机制,又保持了相对的稳定性,即形成与不同发酵类型相对应的特征顶级群落生态系统,顶级群落中微生物通过种间竞争和协同作用选择优势种群,形成复杂的生态学决定关系[4~5](图2)。
2.1 乙醇型顶极群落的结构模式及生态演替
产酸发酵反应器的乙醇型发酵是以H2为主要气相产物,乙醇、乙酸为主要液相产物的发酵类型,在ORP、pH特别低的情况下,以产生乙醇的方式保证细胞内部的正常pH值,以维持机体正常产能和合成代谢,同时每产生1mol乙醇,氧化NADH的量为2mol,以此实现NAD+/NADH的耦联,并产生1mol氢气见表1。乙醇型发酵具有很强的稳定性,不同反应器及不同运行阶段的乙醇型发酵微生物优势菌群见表2。
2.2 丙酸型顶极群落的结构模式及生态演替
丙酸的产生和积累对厌氧生物处理系统有重要的影响,导致系统pH降低而发生“酸化”,致使产甲烷菌失活[6]。主要原因是丙酸在产甲烷相的产乙酸过程缓慢。丙酸型发酵的典型细菌丙酸杆菌属无氢化酶,不产生氢气。丁酸型发酵的主要限制性因素为较高的ORP和pH5.0。不同反应器及不同运行阶段的丙酸型发酵的顶级群落中优势种群见表3。
2.3 丁酸型顶极群落的结构模式及生态演替
从微生物代谢角度讲,pH接近中性时细菌以合成代谢为主,数量的增殖增加了ATP的消耗量,而丁酸型发酵的单位ATP产量是3,因此被选择。在环境中ORP较低、pH为6.0和5.0左右发生的是丁酸型发酵。而较高ORP、pH为5.0时的丙酸型发酵是由于丙酸杆菌的兼性需氧性所致。不同反应器及不同运行阶段的丁酸型发酵的顶级群落中优势种群见表4。按照Odum生态学的观点分析,在调节pH、ORP的生态演替过程中,环境中的顶极群落受环境中生态因子的制约而呈现一定的演替过程,最终被环境条件所选择的微生物成为优势菌群,这是群落“进化”过程中功能由量变到质变的过程,这一过程包括以下阶段:(1)各种发酵类型微生物之间复杂的种群关系通过微生物的生理代谢调节作用,与生境相适应的优势种群得以生长繁殖;(2)同种发酵类型微生物顶极群落的内平衡与反馈调节能力;(3)不同发酵类型代谢末端产物对群落的制约、调控;(4)顶极群落中某些优势种群(如2）反应器的拟杆菌属)的生态位与反应器内生态条件相似,污泥驯化初期已是优势种群,其优势地位不易动摇。
2.4 演替过程中优势种群的生态位
图4所示是以ORP、pH值组成的产酸相不同发酵类型顶极群落中优势种群的二维实现生态位图。由图3可见,生态因子制约了优势种群的生态演替,在这一过程中,各种类型微生物为形成稳定的顶极群落,通原因。膜组件的材料、MBR的运行条件和活性污泥的性质决定了这些因素的影响程度。(3)通过合理的设计及优化运行条件,结合有效的反冲洗和清洗措施,能够最大限度地控制膜污染和恢复膜通量。
【关键词】 灭菌
摘要：目的：评价可拆卸腹腔镜器械的灭菌效果。方法：将两种腹腔镜器械认真彻底清洗后，用同一方法灭菌后进行细菌学检测。结果：可拆卸腹腔镜器械的灭菌后细菌学检测合格率达100%，不可拆卸腹腔镜器械的灭菌后细菌学检测合格率达仅占87.54%。结论：可拆卸的腹腔镜器械灭菌效果达标，为确保医疗安全，建议购买可拆卸的腹腔镜器械。
关键词：腹腔镜器械；可拆卸；不可拆卸；灭菌；检测
《消毒技术规范》中规定腹腔镜器械用前必须达到灭菌水平［1］。目前市面上有两类不同的腹腔镜器械即不可拆卸和可拆卸的腹腔镜手术器械。为评价两种不同腹腔镜手术器械的灭菌效果，在2003年7月至2004年12月期间，将不可拆卸与可拆卸腹腔镜手术器械进行灭菌效果检测，比较二者的灭菌效果。
1 材料和方法
1.1 材料及设备：选择常用的腹腔镜手术器械如抓钳、分离钳、钛夹钳、肠钳、持针器、薄剪、钩剪、双极电凝等不可拆卸和可拆卸的腹腔镜器械共659件次；灭菌器用广州汇日医疗设备有限公司生产的WAYWIN?2000医用灭菌器及其配机专用的消毒剂（过醋酸和水杨酸）和超声清洗机；Elecsys 2010电化学发光仪由瑞士罗氏公司提供。VITEK-2全自动细菌鉴定系统由法国梅里埃公司提供；生物学监测灭菌效果用枯草杆菌黑色变种芽胞（ATCC9372）；洗涤剂用美国强生公司生产的适酶洗涤剂；吹干器械用高压气枪；纯抗原HbsAg（1.5mg/ml）由广东省临检中心提供。
1.2 器械的清洗：先用流水冲净腹腔镜手术器械的肉眼可见污物，再将所有腹腔镜器械用0.8%的适酶溶液超声清洗30min。可拆卸的腹腔镜器械在清洗前先将器械的各个关节部位全部打开，将操作杆套管、管蕊分离，使内管道及管蕊裸露。
1.3 不可拆卸腹腔镜器械的清洗：因不可拆卸腹腔镜器械的特殊构造，不能拆开器械的各关节及内管蕊等，所关节和内管腔等部位较难清洁。用超声清洗器洗完后，只能靠人手用刷子、针头或尖刀刷洗和挑去夹缝中的污物等，流动水认真仔细清洗器械的各个部位，然后用流水冲洗，再用高压气枪吹干。
1.4 可拆卸腹腔镜器械的清洗：用超声清洗器洗完后，人手用毛刷子流动水下清洗各个部位后，用高压气枪吹干。
1.5 器械的灭菌：将两种腹腔镜器械同时放入同一炉WAYWIN?2000医用灭菌器内，按操作程序进行灭菌；每次均按要求放入枯草杆菌黑色变种芽胞（ATCC9372）进行生物学监测。
1.6 器械灭菌后的细菌学检测：标本采集：将灭菌后腹腔器械前端（接触病人端）按无菌操作放入10ml无菌洗脱液内反复活动关节15次后［3］送检，并均作阳性对照。按《消毒技术规范》医疗器械灭菌效果的监测要求进行检测［4］。在2001年7月至2002年12月期间共灭菌了102炉次，共检测了659份标本。
2 结果
两类腹腔镜手术器械的灭菌效果（见表1）；每炉的枯草杆菌黑色变种芽胞生物指示剂经检测均符合要求。
表1 两类腹腔镜手术器械的灭菌后细菌学检测结果 略
3 讨论
3.1 从表可知，可拆卸的腹腔镜器械灭菌合格率为100%。不可拆卸的腹腔镜器械的灭菌合格率仅有87.54%，检出的细菌中有致病性和耐药性均强的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，可引起难愈性术后感染，不符合灭菌物品的要求（必须达到100%）［5］。两者都未检出病毒。由此可见，为保证腹腔镜手术器械的灭菌效果，避免发生医院内感染，确保医疗安全，应该选用可拆卸的腹腔镜手术器械。
3.2 清洗彻底是保证消毒或灭菌成功的关键［6］。而《消毒技术规范》中要求腹腔镜器械应达到灭菌水平。为确保灭菌效果，器械的各个部件都应便于拆卸和互换，同时强调清洗器械时，要对器械进行彻底拆卸、清洗［7］。腹腔镜手术器械。
3.3 比普通手术器械的构造复杂、精细，有细小的内腔。不可拆卸的腹腔镜手术器械，由于无冲洗管、无法拆开各关节及部件，较难清洗到关节部位及内腔，手术时反吸的血污较难清洗干净，极易残留污物和细菌。WAYWIN?2000医用灭菌器是通过三层过滤的无菌水加上专用灭菌剂（过醋酸和水杨酸者）充分接触而达到灭菌。但由于器械的不可拆卸，灭菌时器械的某些部位无法与灭菌剂接触，存在盲点，而导致器械残留或滋长细菌，存在医疗安全隐患。
3.4 可拆卸的腹腔镜器械，可将器械的操作杆套管、管蕊及手柄等关节部位拆开裸露，清洗方便、彻底。灭菌时器械的各个部位均能与灭菌剂充分接触，不存在盲点，这应是可拆卸腹腔镜手术器械经细菌学检测全部无菌生长的主要原因之一。
3.5 我国自1991年开展腹腔镜手术，在10多年的时间里，腹腔镜外科由于创伤小、痛苦少、恢复快等众所周知的特点，以异常迅猛的速度得到了发展［8］，许多医院都先后开展了腹腔镜手术。但由于各家医院的经济条件不同，所购买的器械档次也不同。为了保证腹腔镜器械的灭菌效果，确保医疗安全，笔者建议，不管购买何种档次的器械，应购买可拆卸的腹腔镜手术器械，以方便清洗和保证灭菌效果，确保医疗安全。现有不可拆卸的腹腔镜手术器械，由于价格较贵，且性能完好，只能逐步淘汰，不可能随便丢弃。建议此类器械采用2%戊二醛浸泡10h，使用前用无菌水彻底冲洗干净再使用。此方法灭菌效果经检测合格率可达100%，能符合要求（另文论述），确保腹腔镜手术器械安全使用。
【摘要】 归纳了纤溶酶原的空间结构和纤溶酶原的活化在血栓溶解上的重要作用，分析了低分子化合物通过改变纤溶酶原空间结构促进血栓溶解的机理。重点叙述了到目前为止发现的complestatin,chloropeptin Ⅰ,stablabin,sarfuctin,glucosyldiacylglycerol等几类具有促进纤溶作用的低分子天然化合物和它们各自的特性，并且叙述了这些化合物促进纤溶作用的机制。
【关键词】 纤溶酶原；纤溶作用；低分了化合物
纤溶系统（纤溶酶原/纤溶酶系统）具有溶解血栓的作用，此外它还与创伤治疗、组织再建、血管新生、炎症反应、排卵、癌的形成与转移、动脉硬化、病原菌的组织侵入等许多生理的、病理的变化过程相关［1，2］，纤维蛋白原是血液中的重要构成蛋白质，正常血浆的含量在2～4g/L，纤维蛋白原由3种线状的糖蛋白分子所构成，蛋白质长链通过二硫键结合在一起形成分子量为34万的纤维蛋白原大分子，以溶解状态参与血液循环，通过血液凝固反应，在凝血酶的作用下纤维蛋白原能被转变成不溶的纤维蛋白（血栓）沉积在血管壁上。纤溶系统的纤溶酶原和纤溶酶原激活剂通过赖氨酸结合位点与纤维蛋白相结合，在该结合部位形成的纤溶酶将纤维蛋白分解，纤溶酶原被两种纤溶酶原激活剂（plasminogen activator,PA)尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator,uPA)和组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)激活成具有活性的纤溶酶，该纤溶体系的活性以及纤溶酶原转换成纤溶酶的变化过程被PA抑制剂PAL-1（plasminogen activator inhibitor 1)、α2-抗纤溶酶（α2-antiplasmin)所调节。
在血液凝固-纤溶体系，一些生理活性成分能够通过（1）促进非活化状态的纤溶酶原向活化的纤溶酶的转化；（2）提高纤溶酶原的血栓结合活性；（3）改变纤溶酶原的空间结构使该酶原处于容易被纤溶酶原激活剂活化的状态；（4）促进血液中微量存在的尿激酶型纤溶酶原激活剂前体（prourokinase)向尿激酶型纤溶酶原激活剂的转化从而开始纤溶作用的爆发式血栓溶解反应，来加快纤溶酶原向纤溶酶的转化或促进纤溶酶的纤维蛋白（血栓）酶解反应过程，血管中因病理作用生成的血栓将被溶解并进而消除血 栓症。从天然化合物中探索针对于纤溶体系的酶原、酶的 特异性生理活性物质作为血栓症的治疗药物将不存在生理性的出血危险性，并且会适用于慢性及早期血栓症状。基 于上述事实和理论基础，利用纤溶体系的酶原［3，18］（plasminogen,prourokinase)、血栓构筑的in vitro检索体系从微生物和海藻的代谢产物中已经发现了纤溶酶原的活性促进物质如complestatin,staplabin,plactins,surfactin和尿激酶型纤溶酶原激活剂前体的内因性活性促进物质glucosyldiacylglycerol等，这些化合物的促进纤溶作用或者是刚被发现、或者是活性低等原因，离临床应用还需要作大量的研究。但由于低分子化合物在微血栓、慢性血栓和使用上的巨大潜力和安全性，在溶血栓药物的研究领域，发现和研究低分子纤溶促进化合物正在成为探索新型纤溶疗法药物的重要途径。一些研究者在探索促进纤溶作用的低分子天然化合物时，发现了一些具有促进纤溶作用的化合物，本文归纳了这些化合物的探索途径、分离纯化、特性和促进纤溶作用的机制。
1 纤溶酶原的空间结构和活化
在血液中循环的纤溶酶原（Glu1-plasminogen;Glu-Plg)具有闭合的空间结构，在血液中被纤溶酶原激活剂低效率的活化［4，5］，这种闭合型的空间结构被存在于N末端80个残基（N-terminal peptide,NTP)中的赖氨酸残基（Lys50或Lys60）与存在于第5个链回环（K5）上的氨基已糖结合位点形成分子内结合键所维持［5，6］，当第5个链回环上的氨基已糖结合位点与纤维蛋白（或细胞受体）相结合时，NTP-K5的相互作用被解除，纤溶酶原分子被转变成开放型的结构，纤溶酶原分子在空间驰豫，从而裸露在纤维蛋白（血栓）表面的赖氨酶残基与纤溶酶原上显露出来的赖氨酸结合位点结合后，在空间驰豫的纤溶酶原被结合到纤维蛋白表面，纤溶酶原进一步被存在于其附近的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)高效率的转变成纤溶酶。由于纤溶酶原其分子结构上的闭合状态与开放状态的转化特性（图1），在纤维蛋白（或是细胞间质）上，纤溶酶原的活性表现出是局域性的，血栓（纤维蛋白）溶解最先开始于赖氨酸残基的周围，其作用机理如图2所示。另外，随着纤溶的进行，Glu-Plg的N末端短肽被丝氨酸蛋白酶纤溶酶所切断，Lys78-plasminogen (Lys-Plg)在纤溶酶所出现的区域产生，Lys-Plg分子由于不带有NTP-K5分子内结合键，所以是开放型构造，容易活化，并且通过高亲和性与纤维蛋白结合。低分子化合物ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)或氨甲环酸(tranexamin acid)结合在K5链回环的赖氨酸结合位点，使Glu-Plg成开放性构型，因此，赖氨酸类似物显著地促进Glu-Plg的活性化，但与此相对，赖氨酸类似物阻碍了纤溶反应（纤维蛋白的分解），这是由于介于纤溶酶原链回环上的赖氨酸结合位点的Glu-Plg-纤维蛋白复合物的形成被阻抑了。在纤维蛋白溶解反应的局域性和纤溶反应的高效性上，血液中的Glu-Plg与纤维蛋白的结合以及由此带来的空间结构的变化发挥着重要的作用。纤溶酶原是由791个氨基酸构成的单链糖蛋白，构成糖约占分子量的2%。从N末端开始顺次分为N末端短肽结构域（N-terminal peptide,NTP)、5个链回环结构域（kringle 1,kringle 2,kringle 3,kringle 4,kringle 5)、酶活性中心结构域和C末端氨基酸。酶活性中心在His603-Asp645-Ser740,uPA或tPA限定分解Arg561-Val562肽键（图中的虚心箭头位置）成双链的纤溶酶，PA（plasminogen activator)切断Arg561-Val562肽键后，N端的A链（或重链）C端的B链（或轻链）。
图中圆圈和其中的字母表示具体的氨基酸及其位置：数字表示从N末端起始的氨基酸序列：实心箭头表示弹性蛋白酶（elastase）、胃蛋白酶（pepsin)、鲜黄蛋白酶V8(aureus V8 protease)的水解位点，共6个；虚心箭头表示纤溶酶原激活剂的作用位点；短横线表示分子内二硫键，共23个；短折线表示糖链；实心圆圈和其中的字母表示活性中心氨基酸及其位置。
Glu-Plg由NTP、5个链回环结构域（K1～K5）、丝氨酸蛋白酶活性中心结构域构成，在K1、K2、K4、K5存在赖氨酸结合位点，K5的赖氨酸结合位点由于也能识别氨基已糖，所以又称作氨基已糖结合位点，能结合肽链中的赖氨酸。Glu-Plg分子的NTP Lys50(或Lys62)在K5的AH位点上形成分子内结合链，维持着紧密的空间结构，对活化作用显示出抵抗性。通过K5与纤维蛋白或细胞受体的结合，以及纤溶酶切断NTP，都会使纤溶酶原的空间结构发生驰豫，从而感受到PA的活性化。
2 促进纤溶作用的化合物
到目前为止，主要的纤溶促进化合物（图3）的特性被归纳在表1，这些化合物的探索途径、分离纯化和纤溶促进机制分述如下。 图3 促进纤溶作用的低分子天然化合物 表1 具有纤溶促进作用化合物的特性注：-没有实验数据；*含有不同于纤溶酶原作用特点的特征
2.1 complestatin和chloropeptin 1 以纤溶酶原和纤溶酶原受体构成in vitro检索体系，用于探索促进纤溶酶原向受体结合的低分子天然化合物。认为促进纤溶酶原向纤溶酶原受体结合的化合物也会促进纤溶酶原和纤维蛋白（血栓）的结合，进而促进血栓的溶解。以U937细胞作为纤溶酶原受体的供体，使用人纤溶酶原构成了纤溶促进化合物的检索体系，在对约5000株微生物的代谢产物进行筛选的基础上，从链霉菌属（Streptomyces)的一株代谢产物中发现了低分子化合物图3）complestatin和chloropeptin 1［7,8］促进了纤溶酶原向U937纤溶酶原受体的结合。该化合物是从土壤的分离菌株中分离纯化的，将活化培养的种子液接种到由可溶性淀粉3%、肉膏1%、混合溶液1.5%、玉米浸出汁2%和消泡剂CB442 0.01%构成的液体培养基（pH7.0）中，在25℃、310 rpm的条件下连续培养3天，收获的菌丝用70%丙酮溶液提取，提取物用乙酸乙酯萃取，萃取物经丙酮-甲醇（5：1）硅胶层析后，活性化合物被移动相为含0.2%三氟醋酸的45%乙氰水溶液的高压液相色谱柱（Inertsil PREP-ODS)所精制。
chloropeptin 1是complestatin (c61H45N7O15Cl6,MW1325)的异构体，只在苯甘氨酸-色氨酸残基的结合位置不同。complestatin和chloropeptin 1在0.5～10μM的添加浓度下，使Glu-Plg向U937细胞的结合增加了2～5倍，这些化合物由于也增加了Glu-Plg和纤维蛋白的结合，所以可以认为这些化合物是作用于纤溶酶原的，另外，这些化合物的作用能被ε-氨基已酸所阻碍，并且从化合物的作用特点能认为纤溶酶原和U937细胞没有形成新的结合方式，是complestatin和chloropeptin 1促进了纤溶酶原和U937细胞介于赖氨酸结合位点结合的增加。伴随着纤溶酶原向细胞或纤维蛋白结合的增加，细胞或纤维蛋白上纤溶酶的生成也增加了。在使用全血形成血栓的纤溶实验上，确认了两种化合物介于tPA促进了血栓的溶解［8］，这之后，又确认了这些化合物带来了Glu-Plg空间结构的变化以及促进了介于uPA的Glu-Plg的活性化，从Glu-Plg空间结构的变化也能说明Glu-Plg向U937细胞结合的增加。另外，这些化合物不能直接促进纤溶酶以及纤溶酶原激活剂的酰胺分解活性。
2.2 萜类化合物（staplabin,SMTPs: Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol) 在探索Glu-Plg和纤维蛋白结合的促进化合物上，利用纤溶酶原-尿激酶前体-S2251的in vitro筛选体系，从微生物的培养液发现了新型的萜类代谢产物［9］，这之后，又发现了8种新型同类化合物［10～12］。Staplabin（图3）具有显著的促进纤溶作用，该化合物分离于土壤微生物Stachybotrys Microspora的一个菌株。将经过种子培养的菌株接种到1L培养液含30g葡萄糖、10g脱脂豆粉、3g肉膏、3g酵母粉、3g蛋白粉、0.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁和0.1g消泡剂CB442的培养基中，在25℃、180rpm用500ml三角瓶连续培养3～5天，培养液离心后，上清液用等量的2-丁酸抽提，抽提物用二氯甲烷和甲醇展开于硅胶层析柱，活性成分被Inertsil SIL-ODS精制，移动相是流速为9.9ml/min的乙烷和乙醇（98：2）的混合溶液。
300～500μM的staplabin使Glu-Plg和Lys-Plg与纤维蛋白的结合增加了，这种增加依赖于Glu-Plg和Lys-Plg上的赖氨酸结合位点，并且在纤溶酶原激活剂存在下，Glu-Plg和Lys-Plg的活化被促进了，所以体现出提高了纤溶酶的分解活性［13］，在使用分子排除层析的实验上由于该化合物部分地缩短了Glu-Plg和Lys-Plg的溶出时间，所以被认为该化合物使这些分子驰豫。纤溶酶原活性化的促进作用在ε-氨基已酸（epsilon-aminocapronic acid)和纤溶酶原断片存在的情况下也能观察到，所以能认为staplabin带来的构型的变化和complestatin这些化合物带来的变化是不同的［13］，这种结果，也被staplabin的活性化促进作用能在mini-Plg上观察到的事实所支持。SMTPs Stachybotrys Microspora Triprenyl Phenol）（图3）也显示出同样的作用，但是SMTP-6、SMTP-7、SMTP-8与staplabin相比活性增加了3～10倍。
2.3 环肽化合物 在血浆存在下，利用U937细胞，探索促进125I-纤维蛋白分解的促进物质时，发现了4种新型物质plactins［14］（图3）。
在和50种合成诱导物比较之后，发现plactins的D-Arg(或D-Lys)残基和4个疏水残基的立体配置构型是显示活性所必需的结构［15］。20～50μM的plactin介于血浆中的因子将细胞表面的单链的尿激酶前体转变成活化型的双链结构，而开始了纤溶反应。该活化机制比较复杂，介于多个因子的多条途径引起了促进纤溶作用。将Plactin 2.5～5mg/kg投于肺栓塞小鼠，小鼠栓塞肺的纤溶活性被促进了2～3倍。在uPA存在下，40～60μM的plactin使Glu-Plg的活化被提高了10倍，并且plactins使Glu-Plg的内部荧光增加了5%，但plactins对Lys-Plg的活性没有影响。与前述的化合物不同，plactin没有增加Glu-Plg与纤维蛋白的结合。该化合物在血浆/U937细胞体系将纤维蛋白的分解提高了3～4倍，但在Glu-Plg/U937细胞体系和Glu-Plg/uPA体系，没有促进纤维蛋白的分解，这暗示着plactin的促进纤溶作用依赖于Glu-Plg以外的通路。
2.4 脂蛋白（surfactin) 在尿激酶前体和纤溶酶原构成的反应体系中，尿激酶前体的内因性活性作用带来了Glu-Plg的活化，从纤溶酶原转化生成的纤溶酶将进一步把尿激酶前体转变成具有充分活性的尿激酶，利用该正反馈体系，从细菌的代谢产物发现了尿激酶前体-纤溶酶原反应体系中促进纤溶作用的物质surfactin类化合物，该类化合物是一种脂蛋白［16］（图3）。
从土壤分离到的一株枯草芽孢杆菌的代谢产物被检索出来具有促进纤溶作用，将该菌株用普通细菌培养基在28℃、180rpm连续培养5天后，将培养液用2-丁醇提取后，提取物用乙氰-0.1%乙酸（60：40）展开于高压液相色谱柱Inertsil PREP-ODS上，活性成分经浓缩和冻结干燥后得到了脂蛋白surfactin。
3～10μM的surfactin C使纤溶酶原和尿激酶前体的转换被提高了3～4倍，这种促进作用是由于surfactin C促进了尿激酶引起的Glu-Plg的活化。Surfactin C也促进了Lys-Plg的活化，但surfactin C不影响mini-Plg的活化，在ε-氨基乙酸存在下也不影响Glu-Plg的活化，这个结果暗示着surfactin C作用于纤溶酶原链回环的K1、K2、K3、K4中的某个或某几个结构域，因为ε-氨基已酸作用于纤溶酶原链回环的K5结构域，而不影响纤溶酶原链回环的K1、K2、K3、K4结构域。surfactin C使Glu-Plg的内部荧光增加了7.4%，有分子排除层析实验上使Glu-Plg的溶出时间缩短，从这些结果上能判断Glu-Plg的空间结构被驰豫了。该化合物促进了Glu-Plg和纤维蛋白的结合，在pro-uPA/Glu-Plg,uPA/Glu-Plg,uPA/血浆体系促进了纤溶作用。该化合物（1mg/kg)和pro-uPA投于肺栓塞大白鼠，125I标记的大白鼠肺栓塞的溶解速度与对照相比被提高了3倍。
2.5 脂类化合物 利用纤溶酶原和尿激酶前体的相互活化作用，探讨了具有促进纤溶作用的天然化合物，对700多种植物提取液进行筛选的结果，从海藻中发现了一种稀有化合物α-D-葡萄糖甘油二酯［17］（图3）的促进纤溶作用。将干燥的褐藻添加到三氯甲烷和甲醇的混合有机溶剂（HCCl3：CH3OH=2：1）中，用组织捣碎机充分破碎，过滤之后回收滤液，针对残渣重复一次上述的提取过程，再用提高了溶剂极性的混合液（HCCl3：CH3OH=1：2）提取残渣中的可溶性物质。把三次提取的滤液混合，经减压浓缩和真空干燥，从褐藻中得到了粗提取物，该粗提物经3次柱层析后得到了精制的生物活性物质α-D-葡萄糖甘油二酯。
相当低浓度的葡萄糖甘油二酯（0.66μM)促进了纤溶酶原和尿激酶前体的相互活化作用，而半乳糖甘油二酯在20倍于α-D-葡萄糖甘油二酯的浓度下，仍然不能促进这种纤溶酶原和尿激酶前体的相互活化作用。从这两种结构相似的中性甘油糖脂质的不同作用上，能够推测α-D-葡萄糖甘油二酯的促进纤溶作用不是这一类化合物的共同特性。在高浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂存在、纤溶酶原和尿激酶前体相互活化、尿激酶前体不发生活性化开裂的反应体系中，α-D-葡萄糖甘油二酯促进了纤溶酶原的活性化开裂，由此说明α-D-葡萄糖甘油二酯作用于该体系中的尿激酶前体，提高了尿激酶前体的内因性尿激酶型纤溶酶原激活剂的作用。与此相一致，纤溶酶原/尿激酶前体相互活化反应体系的另外两个反应，既纤溶酶引起的尿激酶前体的活化反应和尿激酶型纤溶酶原激活剂引起的纤溶酶原的活化反应，α-D-葡萄糖甘油二酯对这两个反应的影响是相当小的。进一步的研究发现，葡萄糖甘油二酯带来了尿激酶前体内部荧光的有意义增加以及它不影响纤溶酶原和尿激酶型纤溶酶原活化因子的内部荧光的变化。由这个结果能够推测葡萄糖甘油二酯带来了尿激酶前体空间结构的变化，并且能认为尿激酶前体的这个空间结构的变化与尿激酶前体的内因性纤溶酶原激活剂的作用有关。首次发现了提高尿激酶前体的内因性活性的天然生理活性化合物。
3 讨论
到目前为止，作为酶抑制剂的天然化合物是合成化合物已经知道的很多，但与此相对，如果除去辅酶、金属盐类和酶原保护剂等物质，作为酶活化剂的物质的数量是相当少的。上述所叙述的化合物不是作用于酶而是作用于酶的前体-酶原，这些化合物所以能够被确定为具有活性作用，得益于纤溶酶原分子的独特结构。当机体受到内在或外在的刺激，凝固-纤溶系统迅速对应的必要性被通过蛋白质空间结构的变化（与酶的活化有关）体现出来，这被认为是机体进化的一个方面。纤溶酶原是这种变化过程的一个典型，发现的这些具有促进纤溶作用的化合物使纤溶酶原的空间结构发生微妙的变化从而促进了纤溶作用。从以上的这些事实还能够进一步推测纤溶因子如纤溶酶、尿激酶、尿激酶前体的活性化合物也会促进血栓纤维蛋白的溶解，并且纤溶系统抑制因子的抑制化合物也会促进血栓纤维蛋白的溶解。
溶血链球菌产生的链激酶等细菌的代谢产物和纤溶系统的关系从很早以前就知道了，最近又从侵染性的多种病原菌中发现了纤溶酶原的受体［2］，这些受体被认为与病原性细菌的侵入和组织侵入有关。与这些受体蛋白质相比较，上述叙述的化合物是低分子化合物，这些低分子化合物来自于细菌、放线菌、霉菌和海洋生物，作用于纤溶酶原或是尿激酶前体。产生这些化合物的生产菌和高等动物的关系如何？虽然目前的材料还不充分，但这些化合物的存在也让研究者能进一步探索这些化合物在病原菌侵染、组织纤溶、癌细胞游走和血栓疾病治疗上的巨大价值。
被应用于纤溶疗法上的酶或高分子蛋白如尿激酶、tPA等，主要是应用于心肌梗塞等重度血栓疾患的治疗上，它会带来全身出血的重大危险性，与此相对应，作用于纤溶酶原和尿激酶前体的低分子化合物会使生理的纤溶反应平稳的进行，特别适用于慢性疾患的治疗以及血栓疾病的前期，这些化合物正被人们期待着能成为安全、高效的血栓治疗药物。
摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。
关键词：城市生活垃圾 微生物 强化微生物处理技术 基因工程
随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的环境污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipal solid waste, 简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。
1. 城市生活垃圾生物处理中主要的微生物
MSW生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。
1.1 城市生活垃圾好氧生物处理中的微生物
1.1.1 细菌
在MSW好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在分类学上具有多样性，主要有假单胞菌属（pseudomonas）、克雷伯氏菌属（klebsiella）以及芽孢杆菌属（bacillus）的细菌[1]。在堆肥过程中，细菌总数的变化趋势是高-低-高。堆肥初期，有机废物中携带有的大量细菌分解有机物质释放能量，使堆体温度上升，此时，常温细菌受到抑制，嗜温细菌活跃；当堆温升至高温阶段，只有少量的嗜热细菌可以活动；高温期过后，随着有机成分的减少，堆体温度降低，嗜温及常温细菌又开始活跃，使细菌总数上升。整个好氧降解过程中，嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物。
1.1.2 放线菌
放线菌具有多细胞菌丝，可以分解一些纤维素,并溶解木质素。它比真菌能够忍受更高的温度和pH值,在垃圾生物降解的高温阶段是分解木质纤维素的优势菌群。研究表明，诺卡氏菌（nocardia）、链霉菌（streptomyces）、高温放线菌（thermoactinomyces）和单孢子菌（micromonospora）等在MSW好氧堆肥中占优势[1]。
1.1.3 真菌
在MSW生物降解过程中，真菌对垃圾有机成分的分解和稳定化起着重要的作用。真菌不仅能分泌胞外酶，水解有机物质，而且由于其菌丝的机械穿插作用，还对物料起一定的物理破坏作用，促进生化反应。温度是影响真菌生长的重要因素之一，堆肥过程中随着温度的升高,真菌的菌落数开始减少,在64℃左右,嗜热性真菌几乎全部消失。当温度下降到60℃以下时,嗜温性真菌和嗜热性真菌又都会重新出现在堆肥中[2]。
1.2 厌氧生物处理微生物
MSW的厌氧生物处理依次分为水解、产氢产酸和产甲烷三个阶段，每个阶段各有其独特的微生物类群起生物降解作用。
1.2.1 水解细菌
水解阶段水解细菌利用胞外酶对有机物进行体外酶解，使固体物质变成可溶于水的物质，然后细胞将其吸收，水解成不同产物，该阶段起作用的细菌为水解细菌。Hungate分离出了以下几种水解菌：（1）产琥珀酸拟杆菌属,（2）湖生(lochheadii)芽孢菌属,（3）柱孢梭菌属,（4）生黄瘤胃球菌,（5）白色瘤胃球菌落,（6）溶纤维丁酸弧菌。同时还分离出纤维酶B—1,4—葡聚糖酶,外B—1,4—葡聚糖酶和纤维素二糖酶[3]。
1.2.2 产氢产乙酸菌群
产氢产乙酸菌群是将第一阶段发酵产物如丙酸等三碳以上有机酸、长链脂肪酸和醇类等氧化分解成乙酸和分子氢。在卫生填埋场中已分离出产氢产乙酸菌布氏甲烷杆菌属和G株布氏甲烷杆菌属等[3]。
1.2.3 产甲烷菌群
甲烷菌利用H2/CO2、醋酸和甲醇甲酸等C类化合物为基质，将其转化为甲烷。在卫生填埋场中,产甲烷菌群分杆状菌、球状菌和八叠球菌三类。杆状产甲烷菌通常呈弯曲、链状或丝状,此类细菌有史密斯甲烷短杆菌属、甲酸甲烷杆菌属、巴氏甲烷杆菌属、反刍甲烷短杆菌属、史密斯甲烷杆菌属、嗜热自养甲烷杆菌等；球状产甲烷细菌直径为0.3～5微米,球形细胞呈正圆形或椭圆形,成对排列成链状。此类细菌有巴氏甲烷八叠球菌、范尼氏甲烷球菌、沃氏甲烷球菌、马氏产甲烷球菌、海生产甲烷球菌及嗜热无机营养甲烷球菌等。八叠球状产甲烷菌,其细胞繁殖成规则、大小一致的类似砂粒的堆积物,有227巴氏甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、嗜热甲烷八叠球菌等[3]。
2. 微生物技术在MSW处理过程中的应用
MSW的生物处理主要是利用微生物在一定控制条件下，使有机物发生生物化学降解，形成一种稳定的化合物的过程。因此，微生物对垃圾中有机物降解的快慢、对有机成分降解的程度直接决定着处理周期的长短和处理效果的好坏，在MSW处理过程中起着决定性的作用。故MSW生物处理的优劣取决于微生物自身的结构、所处环境下的代谢状况。目前有很多学者在此方面做出了很大的努力，通过分析某种处理环境下微生物的特性、采用多种方式改变工艺中微生物的数量，质量等，开发出了多种MSW生物处理技术，如：强化微生物（纯种分离、强化接种、添加微生物菌剂、微生物固定化）以及基因诱变等技术。
2.1 强化微生物处理技术
强化微生物处理技术是从改变工艺中单位反应器空间内微生物的质量或数量的角度来增强MSW的降解率，从而提高处理效率，缩短处理周期。
2.1.1 纯种分离
自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。为了提高工艺中某种有效微生物的质量（纯度），提高处理效率，必须进行微生物的纯种分离技术。常见的纯种微生物的分离方法有平板划线分离、液体稀释法分离、利用选择培养基进行分离以及菌丝尖端切割分离[4]。
（1） 平板划线分离
将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图1)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
图1 几种划线方法示意图
（2） 液体稀释法
将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。
（3） 利用选择培养基进行分离
不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。
（4） 菌丝尖端切割
这种方法适于丝状真菌。用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落。
2.1.2 强化接种处理技术
纯种分离后还要将微生物接种到垃圾中进行生物处理，但由于接种微生物的生存环境发生了变化，故在微生物适应周围环境前，处理效率达不到理想的效果，因而直接在垃圾中进行微生物接种的处理效果则应好于微生物纯种分离后再接种的处理效果。直接在垃圾中进行微生物接种可采用多种方式，如：垃圾渗滤液循环、加入一定比例的垃圾腐熟物等。
微生物对垃圾的降解是在多种微生物的协同作用下完成，在适宜的条件下，微生物协同作用能力的大小取决于微生物种群的大小与结构的稳定性。一般说来，生物的种群越大，其自动调控能力越好，适应性就越强，结构越稳定。经垃圾渗滤液循环或向待处理的新鲜垃圾中加入一定比例的垃圾腐熟物进行强化接种培养后，微生物的种群扩大，且循环次数越多，微生物的数量和种群就越大，这样就会更有利于对垃圾的降解。
2.1.3 添加微生物菌剂
研究表明,单一的细菌、真菌、放线菌群体,无论其活性多高,在加快垃圾生物降解进程中的作用都比不上复合微生物菌群的共同作用[5]。微生物菌剂是采用分离、筛选的有效微生物，配合一定的处理工艺和设备，通过合理地调配各种有效微生物的含量，进行筛选、培育MSW生物处理的高效复合微生物菌剂，进而来调节菌群结构、提高微生物降解活性，提高微生物降解有机成分的效率。复合微生物菌群中既有分解性细菌，又有合成性细菌；既有纤维素分解菌、真菌，又有放线菌。向工艺中添加复合微生物菌剂，不仅增加了工艺中微生物初始浓度，而且改善了工艺中微生物的种群结构。作为多种细菌共存的一种生物群落，依靠相互间共生增殖及协同作用，代谢出抗氧化物质，生成稳定而复杂的生态系统，使得整个生物降解过程中微生物数量保持相对稳定，处理效果较佳[6]。
2.1.4 固定化技术
固定化微生物技术是将微生物固定在载体上，使其高密度密集并保持其生物功能，在适宜的条件下还可增殖，以满足处理工艺的要求[7]；实质上是从增加单位反应器内微生物数量的角度来提高微生物的活性，使得细胞密度高，微生物流失少、不需分离，就能纯化和保存高效菌株等优势，反应速度快，运行稳定、可靠，从而节约运行成本，提高MSW的处理效率。固定化微生物技术目前国内外还没有一个统一的分类标准，方法也多种多样，主要有载体结合固定化（吸附法）、交联固定化、包埋固定化和共价结合法，各种固定化方法和载体都各有特点,见表1。其中，微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用。包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中，从而使微生物固定化；其特点是可以将固定化微生物制成各种形状(球状、块状、圆柱状、膜状、布状、管状等)，但包埋法制得的固定化微生物对传质有一定的影响。吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上，微生物细胞与载体之间不起化学反应，并且具有操作简单、固定化条件温和、细胞活性损失小、载体可以反复使用等优点，所以被广泛应用和深入研究[8]。
论文关键词 土壤宏基因组学；研究进展；局限性
论文摘要 土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法，是研究土壤微生物生态学的基础，也是获是土壤中各种基因资源的一种有效手段。介绍了土壤宏基因文库的构建、筛选及土壤宏基因组研究现状和这一技术的局限性。
宏基因组学源于20世纪70年代土壤微生物基因组DNA的直接提取技术的实现，随着微生物学和生物技术的不断发展，Handelsman于1998年提出了宏基因组学的概念[1]。宏基因组学又叫环境基因组学（Environmental Genomics）或群体基因组学（Community Genomics），定义为利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的有机体群落，而不需要分离、培养单一种类的微生物。生物学和化学的结合孕育了宏基因组学的诞生，而宏基因组学的发展需要最大限度的利用现代生物技术和实用筛选技术。
土壤宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法[2]，这种方法从土壤环境样品中直接提取微生物基因组DNA（宏基因组）并克隆于不同载体，再将重组载体转移到适宜的宿主以建立宏基因组文库；同时结合不同的筛选技术，从基因文库中筛选新基因或新的生物活性物质。应用这些免培养的新方法和新技术，可以绕过微生物菌种分离培养这一技术难关，直接在基因水平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源；有利于揭示不可培养微生物的基因多样性，为农业、医药和环境的可持续发展提供丰富的资源。
1土壤宏基因文库的构建
关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道[3]，文库的构建需要足够高质量的DNA，由于土壤微生物往往会与土壤其他组分紧密结合，这就增加了提取土壤DNA的难度[4]。常用的方法包括直接提取法和间接提取法。直接提取法是将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，使其释放DNA，继而抽提纯化；间接提取法是首先去除土壤等杂质，通过不同的离心速度从土壤中分离出细胞，然后对细胞进行抽提。直接提取法提取的DN段较小（1~50kb），提取率高，操作简单；间接提取法提取的片断较大（20~500kb），纯度高，但操作繁琐，有些微生物在分离过程中会丢失。
根据插入片断大小，可以把基因文库分成2类：质粒载体的小片段插入（小于15kb）和柯斯质粒（15~40kb）或BAC（细菌人工染色体）（超过40kb）载体的大片段插入。大肠杆菌（Escherichia coli）是表达土壤细菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭载体或BAC文库可将大肠杆菌包含的文库信息转移至其他宿主如链霉菌或假单胞菌[5]。
载体系统的选择取决于所提取土壤DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子；而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则需要构建大片段和大容量的载体文库。Rondon直接把环境DNA克隆到低拷贝BAC载体，以大肠杆菌作为宿主构建了含100Mbp 的小文库（SL1），
并从这个文库中检测到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。
2土壤宏基因组文库的筛选
宏基因文库的筛选主要有功能驱动筛选、化合物结构水平的筛选、序列驱动筛选，底物诱导基因表达筛选。功能驱动筛选是根据重组克隆产生的新活性进行筛选，在工业上有很多重要的酶就是用这种方法发现的。其主要缺点是要在寄主中进行功能表达，造成筛选工作量大，效率低。化合物结构水平的筛选是根据不同结构的物质在色谱中有不同的峰值，通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。此方法工作量大，费用高。序列驱动筛选是不依赖重组基因在宿主中表达来筛选，而是根据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物，通过杂交进行筛选具有目标序列的克隆子。底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选，这种方法已经成功的从宏基因中筛选出芳烃化合物诱导的基因。国内外的资料显示这4种筛选方法可以筛选到所需要的物质，但筛选效率低，费用高。
3土壤宏基因组研究现状
利用宏基因组学的技术，科研人员筛选到了许多功能基因，加拿大TerraGen Discover公司最先在以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到了具有抗菌活性的5种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯载体构建了含5 000个克隆子的环境基因组文库，采用PCR 序列分析的方法，筛选出编码聚酮合成酶的新基因，同时采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种新的化合物，两者互为同分异构体；Yun等选用pUC19为克隆载体构建大肠杆菌基因组文库，利用活性筛选方法，从30 000个重组子中筛选出1个含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。
2005年，LimHK等以枯草芽孢杆菌为宿主，建立了森林土壤的宏基因组文库，筛选到2个具有抗菌活性的克隆，对其结构进行分析，得出其中一个为产红色色素的靛玉红，另一个为产蓝色色素的靛蓝，是靛玉红的异构体。2006年，Voget S等首次研究了从土壤宏基因组文库中筛选到的一种纤维素酶的性质，证实了其具有较广的pH值和温度适应范围，并且在较高的盐度时也具有活性，具有工业应用价值。
4土壤宏基因组学的技术局限性
总DNA提取技术尚存在一定的限制，土壤环境中，由于微生物与土壤颗粒紧密结合的特性以及腐殖酸等抑制性物质存在等原因，从中难以获得适于构建宏基因组文库的高分子量DNA。Bertrand等采用间接提取法，通过Nycodenz梯度离心，所回收的土壤DN段大小己能达到400kbp，但至今基于原位裂解获得>100kbp土壤DNA的提取技术尚未突破，运用原位裂解法构建更大片段环境宏基因组文库（现有的土壤宏基因组文库中，平均插人片段最大为44.5kb）仍是一个难点。不可避免地，环境宏基因组文库所包含微生物基因组信息的偏差将直接导致“基因遗漏”现象发生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，却在测序量高达1.6Gbp的马尾藻海水宏基因组文库中被遗漏，表明仅运用宏基因组学技术同样会忽略部分的微生物资源。
阳性克隆筛选频率低是宏基因组学的另一个瓶颈所在，运用经典的功能筛选方式，往往是在数千个，甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆，造成此局面一个重要的原因是外源基因的异源表达水平低下。目前根据核酸序列相似性及基因保守区设计探针或引物的杂交、PCR筛选方法，从文库中发现新基因的比率尚不到已知基因的40%。
环境微生物宏基因组研究能让我们发现存在于不可培养微生物中的一些重要的生理过程。许多实验室已经开始努力从不可培养土壤生物的基因组序列中去获得重要的基因，特别是从Acidobacterium组中，因为它是土壤中最常见的细菌。这些数据提供了关于这些生物在土壤中扮演角色的线索。随着足够序列信息的获得，这些生物的代谢途径将被构建出来，引导我们采取有效的策略去培养这些生物。这些数据也将准许我们构建包含所有已知开放阅读框的微生物芯片，来确定这些基因在时间和空间上的表达状况。
尽管宏基因组技术本身还存在着一些局限性，但它为土壤微生物的研究提供了一种有效的研究策略，尤其是对于99％以上不能获得纯培养的土壤微生物来说，宏基因组学不仅是研究土壤微生物生态学的坚实基础，更是我们获得土壤中各种基因资源的一个有效手段。
【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法。方法 测定硝酸咪康唑搽剂对大肠埃希菌等5种试验菌的回收率，对2个控制菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）的检查方法进行验证。结果 用薄膜过滤法和0.1%吐温80-ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂检查本品的细菌总数、真菌及酵母菌计数，其试验菌回收率均达到70%以上。同样用该方法检查本品的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，其试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。结论 用薄膜过滤法联用0.1%吐温80-ph7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂可以消除硝酸咪康唑搽剂在试验条件下的抑菌作用，从而顺利检出该品种所污染的各种微生物。
【关键词】 硝酸咪康唑搽剂；微生物限度检查；方法学验证
微生物限度检查法是检查非规定制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查［1］。但具有抑菌成分的药品由于其抑菌活性的干扰，常规检查结果不能真实地反映出药品中污染微生物的情况，必须先消除供试品中的抑菌活性，再根据《中国药典》规定的方法进行检查，并必须对所采取的检查方法进行验证，以确认抑菌活性的消除和检查方法的可靠性。具有抑菌作用的药品，每个品种抑菌效果不同，因此适合各个品种的微生物限度检查法也不同。
作者曾用常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法（用ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液冲洗）对硝酸咪康唑搽剂进行微生物限度检查，结果均不能达到药典要求。吐温80是亲水性表面活性剂，具有增溶作用，因此本文选择用薄膜过滤法联用0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲溶液做冲洗剂检查该药品的细菌、真菌、酵母菌数和控制菌，结果满意，可为同类药品的微生物限度检查法提供科学依据。
1材料
1.1菌种大肠埃希菌(escherichia coli)［cmcc(b) 44 102］, 金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］, 枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)［cmcc（b）63 501］, 金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［cmcc(b) 26 003］，铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）［cmcc(b)10 104］白色念珠菌(candida albicans)［cmcc(f) 980011］, 黑曲霉(asperg illus niger)［cmcc(f) 98003］，由广东生物研究所提供，菌种代数均为第3代。
1.2培养基及试剂ph7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液、营养肉汤、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、虎红培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂、二盐酸二甲基对苯二胺试剂、pdp琼脂培养基、三氯甲烷、甘露醇氯化钠琼脂培养基和革兰氏染色剂。
1.3样品硝酸咪康唑搽剂，阿特维斯（佛山）制药有限公司，批号：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亚砜。
2方法与结果
2.1菌液制备［1］
2.1.1取经37 ℃ 培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌与大肠埃希菌的肉汤培养物1 ml，加入9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 ml中含菌数50～100 cfu的菌悬液，做活菌计数。
2.1.2取经25 ℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 ml中含菌数50～100 cfu的菌悬液，做活菌计数。
2.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入3～5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，做活菌计数。
2.2供试液的制备［2］取本品10 ml，加ph7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液至100 ml，混匀，作为1∶10的供试液。
2.3验证方法
2.3.1细菌、真菌和酵母菌计数法回收率的测定
薄膜过滤法联用0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲溶液作冲洗剂对各试验菌的回收率进行实验，3次独立平行试验结果的均值见表1［3］。
①试验组：取供试液10 ml到薄膜过滤器中,用无菌的0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲溶液冲洗3次，每次100 ml, 并在最后1次冲洗液中加入1 ml的试验菌液（50～100 cfu/ml）冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于预先制备好的营养琼脂培养基或虎红培养基平板上，置30～35 ℃培养48 h或23～28 ℃培养72 h。记录菌落数。试验组的菌回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)÷菌液组的平均菌落数×100%。
②菌液组［4］：在过滤器中预先加入大约20 ml的无菌0.9%氯化钠溶液，再吸取1 ml的试验菌液（50～100 cfu/ml）到过滤器中，过滤。再用100 ml无菌的0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液冲洗1次，取出滤膜，菌面朝上贴于预先制备好的营养琼脂培养基或虎红培养基平板上培养，培养方法同试验组。
③供试品对照组：方法同试验组，但不加试验菌液。
④稀释剂对照组：方法与试验组同，其中供试液用ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液代替。稀释剂对照组的菌回收率=稀释剂对照组平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%
表1各试验菌株的回收率 略
从表1可知，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率、试验组的菌回收率均不低于70%。可用薄膜过滤法联用0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液冲洗方法检查硝酸咪康唑搽剂的细菌、真菌及酵母菌数。
2.3.2控制菌检查方法验证
①试验组：取供试液10 ml到薄膜过滤器中, 用无菌的0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml, 并在最后一次冲洗液中加入50～100 cfu的试验菌（验证铜绿假单胞菌时,试验菌为铜绿假单胞菌），冲洗后取出滤膜放入预先制备好的相应培养基中，依相应控制菌检查法检查。
②阴性菌对照组：方法同试验组，试验菌改为50～100 cfu阴性对照菌（2个控制菌验证的阴性对照菌均为大肠埃希菌）。
③菌液组 ：在过滤器中预先加入约20 ml的无菌0.9%氯化钠溶液，在吸取50～100 cfu试验菌到薄膜过滤器中，用100 ml 0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液冲洗1次。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于预先制备好营养琼脂培养基上，置（36±1）℃培养48 h，记录活菌数［5］。
3次平行试验结果一致，试验结果见表2。
表2对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的验证结果 略
从表2可见，用薄膜过滤法联用0.1%吐温ph7.080?氯化钠?蛋白胨缓冲溶液作冲洗剂检查铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，方法成立。
3讨 论
硝酸咪康唑搽剂为广谱抗真菌药，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亚砜等成分，对皮肤癣菌、念珠菌等有抗菌作用，对某些细菌也有一定抑制作用。《中国药典》2005版规定，对药品在微生物限度检查时，其方法应通过验证，以确认供试品的抑菌活性已被消除而保证检查方法的可靠性。从本品的微生物限度检查法的建立研究可见，选用薄膜过滤法联用0.1%吐温80?ph7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液作冲洗剂来检查本品的细菌数、真菌、酵母菌数及控制菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）的方法有效，在细菌总数、真菌及酵母菌计数实验中，试验菌回收率均能达到70%以上；铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查实验，试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。本文结果可为同类产品的微生物限度检查方法验证提供科学的依据。
【摘要】在医学微生物学和免疫学课堂教学中，采用循序渐进的原则、多媒体课件教学、运用恰当的比喻、采用启发式教学、注重归纳总结、加强综合应用的训练，能有效提高课堂教学质量。
【关键词】医学微生物学和免疫学 课堂教学质量
医学微生物学和免疫学是一门重要的医学基础课，与其他基础课和临床课联系紧密。医学微生物学所研究的对象体积微小、内容琐碎复杂；而免疫学内容大多是深入到分子水平、概念多、抽象、前后章节内容环环相扣、逻辑推理性强。因此在课程教学中难度较大。笔者在十几年的教学实践中积累了一些经验，就如何提高医学微生物学和免疫学课堂的教学质量，谈几点体会。
1 修订部颁教学大纲，使教学内容更符合临床实际
修订部颁教学大纲的部分内容相对于新版教材和临床实际显得有些落后，我们与临床教研室经验丰富的教师经过反复研究，对原教学大纲进行修改。删去免疫学应用中的补体结合反应、增补补体mbl激活途径；根据认知规律按抗原、免疫器官、免疫细胞、免疫分子、免疫应答、免疫学应用的顺序进行讲解。微生物部分将以前要求掌握的脊髓灰质炎病毒改为了解内容；将奈瑟氏菌属、人类免疫缺陷病毒、密螺旋体属等内容改为掌握；增补冠状病毒、禽流感病毒、霍乱弧菌o139、朊粒等较新的内容；增补新发现的“超级细菌”内容；结合学生大多来自农林牧区的特点，特将布鲁菌属、森林脑炎病毒作为掌握内容。修改后的大纲突出重点、兼顾全面、删繁就简、循序渐进，力求教学的先进性与实用性，做到了理论联系实际。
2 采用多种方法提高学生学习医学微生物学和免疫学的兴趣
近年来进入中专学校的学生大多学习基础差，中专所学知识内容与初中不同，内容多而深。因此，学生对基本概念和基本理论的理解能力差；对物质结构的空间想象力差；逻辑思维能力和解决问题的能力差，而这些又是促成大多数学生对学习兴趣低的原因。
美国心理学家布鲁纳提出：“学习的最好刺激就是对相应内容产生浓厚的兴趣。”因此，在讲绪论和新的学习内容时，我都精心设计，激发学生对所要学的内容产生浓厚的兴趣，以调动学生们学习的积极性和主动性。例如：在讲微生物及免疫学的发展简史、补体、革兰氏染色等内容时，就以微生物及免疫学科学家（列文·虎克、革兰等）的真实事迹作为辅助教学的重要手段，通过介绍主人公当时发现问题的背景，遇到过哪些问题及如何解决问题的过程，最终得出什么结论以及有何意义。不仅激发了学生的学习兴趣，而且培养了学生发现、分析及解决问题的能力。例如在讲ⅰ型超敏反应一节时，笔者导入一些人（身边熟悉的老师及学生）在日常生活中因冷热、接触某些食物、花粉、紫外线等过敏；母亲因接触了婴儿含有青霉素的尿液而使其过敏性休克而死亡的案例；我又讲授蚕豆过敏症、面食过敏症、蘑菇过敏症等的临床表现，提高了学生的兴趣与求知欲，授课效果相当好。
授课内容紧贴生活实际，能提高教学效果。例如：在讲消毒灭菌这一节内容时，在煮沸的水中加入小苏打，不仅提高杀菌力，又可防止金属器械生锈。就湿热和干热哪种消毒效果好进行讨论，让同学们以日常生活体会（移动热物品时用干手巾还是湿手巾、皮肤容易被水蒸气烫伤）进行总结。
在教学中选择能突出微生物及免疫学重要基本理论的临床问题，这样就避免理论教学的枯燥与乏味，能活跃课堂气氛，提高学生学习兴趣和教学效果，也能提高学生解决实际问题的能力。例如：输血时为什么要做和怎么做交叉配血实验、儿童及解放军等易受伤人群感染破伤风后如何治疗、治疗时应注意哪些问题？同种异体器官移植物存活率的高低取决于什么？为什么人对同一种疾病的抵抗力不同等等。
3 按照免疫应答的过程，采用循序渐进的原则讲授免疫学基础部分
例如在讲抗原时就采用了如图3—1流程进行讲解，使学生不仅掌握了抗原及相关内容，而且对免疫细胞、免疫分子和免疫应答过程有了初步认识。在讲授免疫细胞、免疫分子、mhc及免疫应答时则采用图3—2流程进行讲解，使学生对免疫学的分子水平有了更深刻的认识，较轻松地就掌握了免疫细胞及免疫分子之间的相互作用及免疫应答等复杂内容。
4 科学运用多媒体课件教学，提高教学效果
目前，多媒体技术在教学活动中应用广泛，越来越体现出其卓越的性能，针对微生物及免疫学课程的内容抽象、较难理解特点，将多媒体教学与传统教学合理配合，能将抽象的变为直接的、静态的变为动态的、繁杂的变为简单的，能充分调动、激发学生学习的兴趣和观察及思考能力，也便于学生对免疫学结构、结构与功能关系的深刻理解，而且学生对所学内容记忆深刻，大大提高了课堂教学效果。例如：免疫球蛋白水解片段的讲授、k细胞的adcc效应、补体的经典激活途径、金黄色葡萄球菌引起烫伤样皮肤综合征、艾滋病临床表现等。
5 运用恰当的比喻，将抽象内容形象化、生动化
在讲授免疫系统时，将中枢免疫器官(骨髓与胸腺)比作是t、b细胞“革命圣地延安”，t、b细胞在此发育分化成熟，并学会了“认清敌我”（识别）的本领后离开，到外周免疫器官（淋巴结、脾脏等）开展工作，并不断巡视（淋巴再循环），一旦出现（衰老死亡和突变的细胞、病原微生物等抗原性异物侵入）情况，t、b细胞立刻识别并在接收到“鸡毛信”（双信号）后分化增殖为效应t细胞及抗体，它们再“招兵买马”（淋巴因子、穿孔素、颗粒酶、补体、吞噬细胞、k细胞等）形成庞大军队以不同方式去“歼灭清除敌人”。
抗原、抗体的特异性好比“钥匙与锁”的关系，“一把钥匙只能开一把锁”。
将补体激活酶促级联反应比作“多米诺骨牌效应”。
6 在免疫学理论教学中注重采用启发式教学
医学免疫学知识连贯性很强，前后章节内容联系紧密。因此在教师的教学及学生的学习过程中，要正确认识免疫学结构体系是学好免疫学的基础。否则学生就会对免疫学的普遍反映是枯燥、难理解、难记忆。因此，教师在授课时要采用启发式教学。启发学生深入思考、讨论，要把前面部分所学习的免疫学基本概念、基本知识、基本原理有机地运用于对各种免疫机制（如抗原识别机制、抗体免疫效应机制、ctl/nk/k细胞杀伤靶细胞的机制、各型超敏反应的发生机制、各种临床常用免疫学检测技术及防治的原理）的学习和领会中去。更要注重启发学生运用所学的免疫学知识认识、理解临床实际问题，临床应用某些抗生素及抗体制剂时应该注意什么问题，怎样避免或减少超敏反应的发生？器官移植为什么要做组织细胞配型？这样学习既能学以致用，又能反过来促进、加深学生对免疫学的认识理解。
7 加强综合应用的练习，注重归纳总结
俗话说得好，“熟能生巧”。成功的关键在于勤学苦练。练习的意义在于检验自己，对学习形成反馈调节，提高学习效果。学生通过做练习可以发现自己在学习中的薄弱环节、认识中的片面和错误，检验学习的效果，同时又是一种将所学书本知识加以运用以解决问题的实习机会。教师通过学生做练习，可以及时发现学生存在的问题，做到真正地因材施教、有的放矢，提高教学质量。
在此基础上还要引导学生进一步横向比较，在深层次上掌握基本知识及基本概念。如抗体与免疫球蛋白的区别、补体活化经典途径、旁路途径及mbl途径的区别、tcr与bcr的区别、mhc—ⅰ和mhc－ⅱ类分子的区别、病毒与细菌的主要区别、致病性葡萄球菌与链球菌在致病因素和在引起局部化脓性感染时各有何特点？能引起食物中毒的细菌有哪些等。通过总结学生们才能更加深刻理解，更好地记忆，从而学好微生物学及免疫学。
只有激发起学生学习微生物学及免疫学的兴趣，把抽象问题形象化、生动化，充分发挥现代化教学优势，采用启发式教学，深入思考讨论，归纳总结，微生物学及免疫学的课堂教学质量一定会得到提高。
作者：崔浩然，牛小宇，刘春生
【摘要】 植物体内大量分布的微生物对植物产生的影响已成为人们关注的热点，特别是那些有益的影响可对植物的生长及活性成分的形成产生一定的作用。甘草作为一种大宗中药，其栽培品的质量一直是人们所关心的问题，甘草有益微生物对提高甘草的品质有重要作用。该文综述了甘草有益微生物的研究进展，以期对提高栽培甘草的质量起到指导意义。
【关键词】 甘草; 内生菌; 根瘤菌; 菌根真菌
甘草是豆科甘草属(glycyrrhiza)植物，其根及根茎为常用中药，市场需求量大。近年来，随着野生甘草资源的急剧减少，且国家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖锐。在这种情况下，对甘草资源的保护性利用及栽培甘草势在必行。近年来，随着人工甘草种植面积的逐年加大，提高甘草的质量成为亟待解决的一个关键问题。相关研究表明，植物有益微生物可以产生促植物生长的活性物质，提高植物固氮性能，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄主植物健康生长。因此本文就近年来甘草有益微生物的研究进展进行综述，以期对提高栽培甘草的质量有指导意义。
1 甘草内生菌的研究现状
内生菌是指一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并且不引起明显组织变化的真菌或细菌［1,2］。1993年，strobel等［3］从短叶红豆杉taxus brevifolia nutt的树皮中分离出二百多种微生物，其中有一株内生真菌taxomyces andreanae能产生紫杉醇，这一研究结果引起学者对内生菌的广泛兴趣。目前，人们已经从长春花、千层塔、银杏、厚朴等多种植物中分离得到了内生菌，并取得了一些成果。
有学者对甘草内生菌也进行了研究，发现内生菌对甘草产生一系列作用。宋素琴等［4］对采自新疆的健康野生胀果甘草不同组织中的内生菌进行分离，并纯化得到149株细菌和2株真菌，鉴定得出149株细菌分属于13个属，2株真菌分属于青霉菌属penicillium和镰刀菌属fusarium。有学者发现内生菌可通过拮抗病原菌促进甘草生长。饶小莉等［5］从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株，并采用平板对峙方法筛选出6株菌株，其对植物病原菌有明显体外拮抗活性，鉴定这6株拮抗菌株分属萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、paenibacillus ehimensis。龚明福等［6］采用无菌操作技术从野生健康甘草glycyrrhiza uralensis的根、茎、叶、种子、根瘤等组织中分离出内生细菌（endophytic bacteria)125株，其中31株对棉花枯萎病菌(fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(verticillium dahliae)具有较强的拮抗活性，这31株内生细菌分属于气芽孢杆菌属(aerobacillus sp.)、气单胞菌属(aeromonas sp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、黄单孢杆菌属(xanthomonas sp.)、假单胞杆菌属(pseudomonas sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)。另有研究发现，从甘草中分离的有些内生菌还可产生活性物质。韦革宏等［7］从乌拉尔甘草和光果甘草中共分离得到68株内生菌，从中筛选出一个来自乌拉尔甘草的菌株mesorhizobium sp. ccnwgx022，从该菌株发酵液的石油醚提取物中分离得到了十八烷酸内酯rhizobialide，是第一次从内生菌中得到此类物质。另有学者研究了内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量变化趋势。林世利等［8］分离出不同月份苦豆子、骆驼刺、苜蓿、铃铛刺、甘草不同部位的内生细菌，研究阿拉尔地区豆科植物内生细菌种群动态。结果显示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的铃铛刺和骆驼刺植株的内生细菌的种类最多。内生细菌种类的分布规律依次为苦豆子中叶＞茎＞根＞种子＞花，苜蓿中根＞叶＞茎＞花＞种子，铃铛刺中茎＞叶＞种子＞花＞根，骆驼刺中根＞茎≥叶＞种子＞花，甘草中茎＞根＞叶＞种子＞花。5种豆科植物生长期中总带菌量平均值在各个月份变化趋势不同，并且各个月份的带菌量处于交替变化之中，说明不同月份5种豆科植物内生细菌的种类和数量不同，同种豆科植物不同组织部位的内生细菌的种类和数量有差异。
2 甘草根瘤菌的研究现状
根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生两种类型，为化能异养菌。目前有学者已经从甘草中分离得到根瘤菌并进行了一些相关研究。
目前对甘草根瘤菌的研究多体现在根瘤菌的分类上。杨雪颖等［9］通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究，发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对新类群的中心菌株ccnwgx022和高抗性菌株ccnwgx035进行16srdna全序列测定及系统进化研究。结果表明，ccnwgx022和ccnwgx035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16srdna相似性分别大于96.8％和98.3％，判定它们均属于中慢生根瘤菌属。谷峻等［10］采用表型数值分类、16s rdna pcr-rflp分析和box-pcr指纹图谱分析的方法对中国北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16sr dna pcr-rflp分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。box-pcr指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。由此得出结论：在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在sinorhizobium、rhizobium和mesorhizobium属中均有分布。
3 甘草菌根真菌的研究现状
菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。凡能引起植物形成菌根的真菌称为菌根真菌，大部分属担子菌亚门，小部分属子囊菌亚门。菌根真菌与植物之间建立相互有利、互为条件的生理整体，并各有形态特征，这是真核生物之间实现共生关系的典型代表。根据形态和解剖学的特征，又把菌根分为外生菌根和内生菌根两大类。有学者对甘草菌根真菌进行研究发现菌根真菌可促进甘草的生长。饶小莉等［11］分离了甘草的va菌根，并用三叶草进行单孢繁殖，将繁殖后的菌根真菌回接甘草，结果发现接种了菌根真菌的甘草植株笔长、根粗、茎叶干重和根干重都有较大程度的提高，均比对照显著增加，并且不同处理对植株生长影响不同，得出结论接种va菌根真菌显著促进了甘草的营养生长。jingnan liu等［12］用两种am菌根真菌glomus mosseae与glomus versiforme接种甘草，结果显示接种的甘草相对于对照组在生长的早期和晚期有显著提高，叶摄取磷的量比对照组多，并且根中甘草酸的浓度有所升高，但根部氧化酶活性相对降低了，由此得出结论接种am菌根真菌有可能成为提高甘草药用价值的有效途径。
4 甘草其他微生物学相关研究现状
近年来，对甘草微生物学转化等方面的研究工作也取得了一定成果。谢毛成［13］利用发根农杆菌的ri质粒，以光果甘草种子胚萌发形成的实生苗不同部位为外植体，成功诱导出光果甘草毛状根，并利用tldna中rolc序列中的特异性引物，应用pcr技术对光果甘草毛状根进行了分子水平的鉴定，并利用理化手段对毛状根转化后产生的冠瘦碱进行了薄层定性鉴定，从不同水平上证实了光果甘草毛状根核基因组中已整合了外源ri质粒的t-dna片段。燕飞等［14］利用发根农杆菌r1601对药用植物胀果甘草(glycyrrhiza inflat bat)进行转化，诱导其产生发根。在发根诱导过程中，分别用不同菌液浓度、不同浸染时间对胀果甘草子叶、胚轴进行转化处理，统计、比较各条件下的发根率，结果表明，用稀释2倍的菌液浸染子叶8 min时，发根诱导率最高,为56.49%。何晨等［15］用一株产β-葡糖醛酸酶的菌种hc-12对甘草进行液体发酵转化。通过对菌种复合诱变以及应用系统数值化及灵敏值系统调控技术优化了发酵工艺，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。经过柱层析及hplc及1h nmr鉴定分离得到了甘草次酸纯品，并通过动物实验验证了发酵甘草于未发酵的生品对照甘草具有抗炎活性和镇痛作用显著性效果。
5 小结
内生菌对甘草的有益作用体现在：①内生菌有促进甘草生长作用，内生菌可与病原菌竞争营养或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进甘草生长。②有些内生菌可产生活性物质。③内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量呈现一定的变化趋势。另有研究表明，内生菌能产生与宿主相同的活性物质［3］，王兴红［16］推测内生真菌可能与中药的道地性有密切的关系。这些成果对于甘草内生菌的研究有重要意义。
根瘤菌对甘草的有益作用体现在：根瘤菌能够通过与甘草共生，引起甘草根部或茎部结瘤，将空气中的n2转化为可吸收利用的nh4，从而为甘草提供氮素营养，促进其生长。
菌根真菌对甘草的有益作用体现在：甘草和菌根真菌是一种互惠共生的关系，它们之间可以交换各自所需的物质，甘草借助菌根真菌吸收水分、养分和生长促进剂，而菌根真菌也从甘草中摄取自身生长所需要的糖分和其它有机物。菌根真菌是根系的延长和扩展，且比根系吸收水分、养分的能力大得多，可促进甘草的营养生长，提高甘草的药用价值。
微生物转化对甘草的作用体现在：对甘草进行微生物转化，可提高其有效成分含量，用药效果可得到提高。
总之，微生物是个潜力巨大、尚待开发的资源，对甘草相关微生物进行研究有重大意义，有利于提高甘草的质量，对于中药的可持续发展也将起到重大作用。
论文关键词：微生物 实验 互动 研究
论文摘 要：环境微生物实验是环境学领域的一门重要基础课程。本文以传统的实验教学方式为基础，提出了以“先立观念，互动教学，科研教学”实验教学模式为核心的实践经验，并从中获得了一些启发与体会。
环境微生物学作为环境工程专业、环境科学专业的必修专业基础课，是以普通微生物学为基础，并在研究微生物学的一般规律的同时，更注重微生物与环境之间的相互作用规律的一门课程[1]。环境微生物是微观的、肉眼看不见的，需要抽象思维，总体而言枯燥乏味。所学知识虽与专业相关，但学生尚未接触科学研究，所学内容离日常生活较远，学习目的性大打折扣，难以激发学生学习兴趣。因此，与其他专业的微生物课程类似，在进行环境微生物学的理论教学的同时，配合一定课时量的实验教学，以其调动学生对理论学习的兴趣，提高对理论知识的认知能力。
另一方面，随着环境微生物学的发展，例如无菌操作、培养基制备、消毒与灭菌、微生物的培养分离计数等微生物学中最基本的一些技术在环境污染处理等生产研究领域中应用十分广泛，对整个科学技术和社会经济发展发挥着重大作用。因而，微生物实验教学也是课程理论与实践应用相结合的桥梁和纽带，在学生专业技能培养中具有十分重要的作用。那么，如何充分调配环境微生物学实验的内容及授课方式，让学生真正掌握所学知识，培养具备理论知识扎实、动手能力强且能将所学知识灵活运用创新能力的学生，一直是值得思考和努力的问题。本文根据环境微生物学实验教学过程中存在的问题，提出了“先立观念，互动教学，科研教学”为中心思想的教学方法，以其为进一步提高环境微生物学实验教学效率提供系列应对策略。
1 先立观念
微生物实验与物理化学实验不同，其研究对象是形体微小、分布广泛、无处不在的细菌、病毒和真菌。尤其是在进行某种微生物的分离、纯化及培养过程中，无菌操作技术是整个实验的重点。尚未接触微生物学实验的学生不能深刻注意到与其它学科实验的差异。其它学科实验的操作是在开放的空气中进行的，而微生物学实验尤其是研究工作中，许多实验操作是在相对隔离的环境中进行的，以保证不受环境中微生物的污染。因此，在学生尚未养成不良实验习惯之前，就必须让其建立无菌操作的概念。笔者在第一次课堂上，就针对整个课程周期内的行为规范要求做一次详细说明，培养学生规范的操作技术。让学生理解什么样的操作是规范的，什么样的操作会引起实验的失败。结果表明，缺少这部分内容的教育，在后面的实验活动中，学生往往会不自觉养成一些不良习惯，无菌操作概念则相当薄弱。因此，我们强调先立观念。大学的环境微生物学实验是他们第一次接触微生物，在最初阶段就让学生知道整个课程的基本规范，会让他们受益匪浅。
2 互动教学应贯穿整个实验教学
常规的实验教学，通常由理论教学和实验教学两部分组成。即，教师讲解本次实验的目的、原理、材料、操作步骤及注意事项，然后学生各自分组按操作步骤进行实验。此处，教师的课前讲解是学生进行实验的前提与基础，是学生是否能充分理解本次实验流程的关键要素。因此，教师工作者十分关注如何能提高教师讲解的效率以扩大学生的理解[2]。笔者发现，若将互动教学法引入到实验课中，同样十分有效，它是充分发挥教师和学生两个主观能动性的教学方法。那么实验课的互动教学法是以何形式出现的呢？笔者通过实践，摸索出了“问答式”、“答问式”、“师生讨论启发式”、“实验结果展现”、“多媒体教学”等多种形式，教师可以根据不同的教学内容，有选择地加以使用。
(1)“问答式”与“答问式”。“问答式”即在讲完实验理论后由教师针对本次实验的关键问题进行提问，然后由学生回答。如“细菌涂片制备与染色”实验中，教师可以询问学生革兰氏染色的原理与步骤等。这不仅能促进学生理解的效率，还能让教师从中了解学生的掌握程度，并可针对学生不懂之处解答；“答问式”则通常在“问答式”之后，即要求学生针对实验提出若干个问题，由教师回答。众所周知，在大多数情况下，中国学生往往会带着疑问进行实验操作，直至出现问题后才会找老师解答，或甚至不问。而这种情况对于实验操作教学是十分不利的。因此，培养学生在实验前把整个过程弄明白，不留疑问的进行后面的实验，是教师们一直以来努力的目标。笔者发现，从第一次课程点名鼓励提问，到后面几次课的踊跃提问，宽松的互动问题环节还是比较受欢迎的。其中有很多问题是教师认为比较简单的一些操作，所以先前并未讲解透彻，而学生却一知半解。当他们提问后教师解答，则能让整个实验的进行事半功倍。因此，让学生习惯并喜欢“答问式”是一个循序渐进的过程，也是一个非常有利于教学效果的方法。
(2)“师生讨论启发式”分两种形式，即口头和书面形式。口头形式通常在课内完成，即在学生在实验期间，与老师的交流。如此，使学生学到较多实验知识与技巧。并且，教师可在下课前集中讲解实验过程中出现的新现象、新问题，纠正学生常见的习惯性错误，培养学生良好的实验操作习惯。书面形式，则是要求同学在完成课内的实验操作后，实验报告除了目的、原理、方法、结果和思考题外，还应有相应的分析和讨论。以往，学生撰写报告往往把实验原理、材料、操作方法和实验数据等简单地罗列，未能对实验中遇到的问题进行分析讨论。为了使学生深刻理解和掌握实验内容，探讨成功的经验和失败的原因，提高分析问题、提出解决方案和实施解决方案的能力，笔者要求学生如实记录操作步骤和实验结果，尤其是鼓励将操作步骤以图示的方式表示出来，而非从资料上抄下来大段大段的文字。此外，鼓励其将实验中出现的各种结果进行分析讨论，对于实验取得与预期相符结果的，分析成功的关键和经验。对于未取得预期结果的，分析导致实验失败的原因。对于学生提交的实验报告，教师在批阅过程中逐一点评。笔者在评阅实验报告时常遇到以下内容：“本次实验失败了，主要原因可能是培养基制备时琼脂浓度过低”；“这次实验我们成功分离到了纤维素降解菌”。这让教师及时了解学生对课程的意见与想法，能促进今后课程开展的及时改进。
(3)“结果展现式”应用的典型例子就是在“显微镜的使用与细菌形态观察”这一实验。这个实验最主要的目的就是让学生通过显微镜的观察，对各种微生物细胞的基本形态特征有一个直接的感性认识。笔者所在教学实验室建立了一个互动实验室平台，即教师显微镜下的视野能直接投影到大屏幕让全体学生看到，每组学生用的显微镜视野也能切换到大屏幕上去。如此一来，所有同学都能看到老师做的微生物装片情况，各组之间的情况大家也一目了然。在观察微生物的形态、大小时，学生对看到显微镜下的物体常有误认。实验中，常常有学生把杂质当作了细菌细胞，需经过老师的指点才能看到了真正的细菌细胞。在互动教室中教师可以在大屏幕上对每一个成像进行分析辨认，从而轻松让每一个学生看到各个小组制作的真实菌体。另外，同学与同学之间也会就实验现象差异进行讨论，交流成功或失败的经验。笔者曾对学生做了调查，90%以上同学都十分认可将自己的实验成果与全班分享。
(4)随着科学的发展，理论部分的教学已离不开多媒体教学，但实验教学大多数仍保持着固有形式，如板书等。为了能在有限的课时内准确生动地将最基本的操作技术介绍给学生，提高实验课程的教学水平，我们在将多媒体技术应用到微生物学实验课程教学方面进行了一些有益的尝试，受到了学生的普遍欢迎。即每次课程均会播放一段教学视频，如“培养基的配制与分装”、“玻璃器皿的包扎”、“细菌的接种”、“革兰氏染色”等。通过生动形象的教学示范，可以让学生更为形象的了解微生物操作技术的细节要求，培养出微生物操作技术更为扎实的学生。或者在“污水中常见微生物观察”实验中，让学生观察后拍摄照片视频录像，并对影响资料进行标注，如添加标尺、调节曝光时间等，通过提高学生的兴趣来增强他们对知识点的记忆。因此，充分利用多媒体的有利条件，将实验课程教学建立在现代教育技术的平台上应逐渐成为当前形式下高等教育改革和发展的目标[3]。
3 实验教学与科研教学的关系
3.1 验证性与研究性教学的有机结合
微生物实验课的开设大多是根据理论教学的进度，设置相对应的实验。实验项目来自实验指导书，书中从实验目的、原理、器材、步骤及注意事项等内容都作了全面而具体的说明，所做实验基本上都是验证性的，学生只需照做，最后完成实验报告即可。整个过程缺少了能让学生好好动脑思考的环节。虽然，实验项目的选择都是从众多实验中筛选出来的具有实际应用价值，但大多是相对孤立的，学生会搞不清实验一和实验二之间有没有关系，有没有学的必要。如果，教师将其中一部分验证性实验项目进行科学合理的串联，使学生掌握基本操作技术后，适当安排一些研究性的实验项目。将实验项目告知学生，要求学生参考实验指导书和相关的期刊，分组写出试验设计，进行研究性学习。教师对各个小组进行具体指导，包括实验步骤、实验所需器材的准备等。同时，鼓励各小组选择不同的实验项目，观察结果时互相交流讨论。如“污水中大肠菌群的测定”这一实验中，可告诉学生采用中华人民共和国国家标准gb/t 5750.12-2006中的多管发酵法，由学生自行去网络资源中查找具体的资料，制作实验方案，由教师审核后开展实验。
3.2 研究性与开放性教学的循序渐进
虽然，上述研究性实验项目能培养学生的独立思考及设计能力，但是以培养高素质的创新人才而言仍然是不够的。因此，还可开设一些开放性实验课程，即3～4个学生组成的项目小组选择某位专业指导老师，开展一个结果未知的研究项目，实现实验教学与科研的真正结合[4]。如“化工废水中某降解菌株的筛选分离”、“水体藻类对某化合污染物的响应研究”等。课题组独立完成实验方案实施的全过程，指导教师随时对实验过程中的技术重点、难点进行指导和把关。教师除平时进行指导外，还定期组织学生进行学术交流。通过学术交流便于指导教师详细掌握各组的实验进度、存在问题等，并指出努力方向。实验结束时，每名学生写出正式规格的实验研究论文，由指导老师进行评定并备案。
总之，以培养学生创新精神和实践能力为重点的素质教育正在普遍实施，我们针对环境微生物实验教学进行的一些“互动”改革，仍是初步探索，期望能对进一步推动实验教学改革的进程提供一些新的思路。
摘要 针对“土壤微生物的分解作用”这个实验在教学中开展出现的几个问题,对实验方案进行了相应的改进,以期对教学实践有一定的参考价值。
关键词 土壤微生物 分解作用 实验改进
“土壤微生物的分解作用”是新课程标准中设置的一项活动,旨在使学生能从实验的角度去探究土壤中落叶等物质的消失源于土壤微生物的分解作用。笔者经调查发现,浙江省新课程实施两年以来,开展该实验的学校寥寥无几,多数一线教师反映该实验周期长、实验现象不明显,而更主要的是大多学校不具备实施该实验的设备装置,鉴于此,下面设计了该实验的3个改进方案,以供大家参考。
1 改进方案一
草莓是在土壤微生物的作用下腐烂的吗?
本实验采用对照实验的方法,设计对照组和实验组。对照组的土壤不做任何处理(自然状态);实验组的土壤要经过高压灭菌处理,以尽可能排除土壤微生物的作用,同时要尽可能避免土壤理化性质的改变。所选用的草莓都要进行彻底灭菌处理。
(1)实验材料:土壤、草莓若干(可根据季节自行选择其他水果)、70%的酒精、升汞。
(2)实验器材:无菌操作台、高压灭菌锅、泡沫碗、铲子、培养皿、镊子等。
(3)实验步骤:
①采集土样。选取适量较肥沃的土壤等量分装于两个泡沫碗中,做好标记备用。
③土壤处理。将其中的一碗土壤用报纸包好,同培养皿、镊子等一起放入高压蒸汽灭菌锅灭菌20 min(实验组)。另一碗土壤不做处理,保持自然状态(对照组)。
③草莓处理。将所选用的草莓用70%的酒精进行10 s消毒处理,并用升汞进行20 min灭菌,最后用无菌水洗3-4次,杀灭草莓表面的微生物。
④将灭菌处理后的草莓分别埋人两盒土壤中(深3-5 cm),并将2组实验材料放入无菌培养室(注意:实验组要在无菌条件下操作)。
⑤隔天观察草莓的腐烂程度,并对其进行描述,得出实验结果。
(4)实验结果:实验第3 d对照组开始腐烂,第5 d实验组个别草莓开始有变化;第7 d,实验组个别草莓有一定程度腐烂,对照组几乎所有草莓都有不同程度腐烂。
(5)实验结论:对照组与实验组除了对土壤的处理不同,其他条件完全一样,实验结果不同,说明未经灭菌处理的土壤中确实存在使草莓发霉的微生物。
2 改进方案二
面包是在土壤微生物的作用下腐烂的吗?
本实验采用对照实验的方法,设计对照组和实验组。对照组的土壤不做任何处理(自然状态);实验组的土壤要经过处理(在微波炉里加热10min),以尽可能地排除土壤微生物的作用,同时要尽可能避免土壤理化性质的改变;面包要在微波炉里面进行灭菌处理。
(1)实验材料:土壤、面包。
(2)实验器材:微波炉、泡沫碗若干、报纸、铲子、镊子、锥形瓶等。
(3)实验步骤:
①采集土样。选取适量较肥沃的土壤等量分装于8个泡沫碗中,做好标记备用。
②土壤处理。将其中的4盆土壤用报纸包好同镊子等一起放入微波炉灭菌20 min,该组为实验组。另4盆土壤不做处理,保持自然状态,作为对照组。
③面包处理。将新烤的面包切成若干大小相等的块状,放在锥形瓶中,将锥形瓶放到微波炉里加热,进行彻底灭菌处理,杀死面包中含有的微生物。
④灭菌处理后的面包分别埋入8碗土壤中(深3-5cm),用报纸将泡沫碗包好,并将2组实验材料放入无菌培养室(注意:实验组要在无菌条件下操作)。
⑤隔天观察面包的腐烂程度,记录实验结果,一周后,实验组面包完好,而对照组面包发霉。
(4)实验结果:实验第8 d对照组开始发霉,第10 d对照组面包上长满了长长的“毛”,而实验组完好。
(5)实验结论:对照组与实验组除了对土壤的处理不同,其他条件完全一样,实验结果不同。这说明未经灭菌处理的土壤中确实存在使面包变质的微生物。
3 改进方案三
探究土壤微生物对淀粉的分解作用。
本探究实验将对土壤微生物的分解作用的探究和对淀粉及还原性糖的鉴定较好的结合在一起,既能完成新的探究实验,又能对必修1中的重要实验“鉴定淀粉和还原性糖”起到很好的复习作用。
(1)实验材料及药品:土壤、淀粉溶液、蒸馏水、碘液、斐林试剂。
(2)实验仪器:高压蒸汽灭菌锅、烧杯、试管、玻璃棒、胶头滴管、酒精灯、电子称等。
(3)实验步骤:
①将取自农田的土壤放入里面垫有纱布的烧杯中,加水搅拌,然后将纱布连同土壤一起取出,将留在烧杯中的土壤浸出液静置一段时间备用。
②取两只锥形瓶,编号a、b,放入等量(约30ml)淀粉溶液,高压蒸汽灭菌20min。
③在a锥形瓶中加入30ml土壤浸出液(实验组),b锥形瓶中加入30 ml无菌水(对照组,需无菌操作),分别用牛皮纸封口(隔菌通气)。
④在室温(20℃左右)下放置7 d后,分别取a、b锥形瓶中的溶液5 ml,各放入两支试管中,分别编号a1、a2、b1、b2。
⑤在a1、b1中加入碘液,在a2、b2中加入斐林试剂并在酒精灯上加热2～3 min。
⑥观察试管中溶液的颜色变化,记录实验结果,得出实验结论。
(4)实验结果:1周后,a1中加入碘液仍为紫色,b1中加入碘液变为蓝色,a2、b2中加入斐林试剂并在酒精灯上加热2-3min没有变化;2周后,a2中加入斐林试剂并在酒精灯上加热2-3min,变砖红色,b2中加入斐林试剂并在酒精灯上加热2-3 min仍无颜色变化。
(5)实验结论:对照组与实验组除了对土壤的处理不同,即所得的土壤浸出液成分不同,其他条件完全一样,实验结果出现不同的颜色,说明了未经灭菌处理的土壤得到的土壤浸出液中存在某些微生物,使得淀粉被分解成为还原性糖。
4 总结
方案一选择草莓作为材料,周期短,效果好,但有季节限制;同时本方案灭菌效果彻底,但对实验仪器的要求也比较高,所以适用于实验设备条件较好的中学。考虑到有些学校实验设备条件有限,没有高压灭菌锅、灭菌台,所以方案二选用微波炉来灭菌,这是生活中常见的电器容易获得,适合实验设备条件一般的中学;同时本方案选择面包作为材料周期较长,但面包价格便宜,且没有季节限制。教材对方案三没有说明加入淀粉糊的浓度和量,以及所加淀粉糊在7 d后是否完全被分解,没作鉴定说明,这将会直接影响实验结果,本文在教材方案基础上针对性的对其进行改进,并增添了鉴定实验,使得实验更加严密,提高了可操作性。
论文摘要：微生物课程是生物制药专业重要的职业基础课程，在本专业的许多课程教学中起着承前启后的作用。本文从生物制药专业发展概况及培养目标入手，对微生物课程教学地位及教学目标进行分析，阐述了微生物课程教学改革的探索与实践。
论文关键词：高职；生物制药；微生物课程；教学改革
生物制药专业发展概况及培养目标
生物制药是运用微生物学、生物学、医学、生物化学等研究成果并综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造用于预防、治疗和诊断的制品。生物制药产业是国民经济的重要组成部分，《中华人民共和国国民经济和社会发展第十一个五年规划纲要》和《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》中明确指出“要大力发展生物产业”。目前，全世界的医药品已有一半是生物合成的。
近年来，我国医药行业的迅猛发展，特别是生物技术在医药产业中的广泛应用大大加快了生物与医药类等高职院校生物制药专业的发展壮大。其培养目标是：德、智、体、美全面发展，具有与本专业领域方向相适应的文化水平与素质、良好的职业道德和创新精神，掌握本专业领域方向的技术知识，具备相应实践技能以及较强的实际工作能力，熟练掌握并能从事药物的研发、药物的生产、药物的质量及安全检验、药理分析、药物的经营和销售等工作的高技能型人才。
微生物课程教学地位及教学目标分析
半个世纪以来，微生物转化在药物研制中一系列突破性的应用给医药工业创造了巨大的医疗价值和经济效益。随着新微生物资源的发现、新的药物筛选模型建立以及各种新技术的应用，从微生物次级代谢产物中寻找新药所显现的优势将继续存在，事实证明微生物制药在整个生物制药产业中占有举足轻重的地位。微生物学在理、工、农、医、师范院校与生物相关专业的课程设置中占有重要的地位，也是一门实践性很强的学科。
由此可见，微生物课程也必然是生物制药专业的重要职业基础课程。它系统地介绍了微生物的分布、分类、形态结构、生长繁殖、遗传变异以及与人类生产生活的关系等理论与实验操作技术，要求学生具备一定的生物学与生物化学基础知识。其后续课程包括发酵工程概论、生物技术制药、制药工艺学、药品分析与检验、药剂学、药事管理与基因工程技术概论等多门主干课程。
本课程的教学目标是使学生能够正确掌握微生物分类、结构、生理活动等基础知识，确保学生能够进行有关微生物生产的必要基本技能操作，并掌握应用微生物学理论知识分析问题和解决问题的基本方法，从而为后续的职业技术课程的学习与生产实践奠定必要的理论基础和实践技能。
微生物课程教学改革探索与实践
长期以来，全国各高校微生物学教学大多以课堂讲授为主，配合适量实验课。学生学习微生物学的方法常常是课上勤笔记少思考、课下不复习少作业，考前死记硬背、考后“完璧归赵”。为了提高微生物课程教学效果与学生的实践技能，我们于2008年申报了《微生物及其应用》院级精品课程，并与全省其他高职院校的同仁一道对生物制药及相关专业的微生物课程教学改革进行了一定的探索与实践。
（一）优化教学手段与方法
主要教学手段 合理利用学院优越的教学条件是提高课程教学质量的基本手段。在本课程教学中，我们充分利用学院完善的多媒体教学资源、电视显微镜设备组织教学，通过多媒体课件、视频、标本与即时的实验操作进行形象、直观的教学。同时，加强与本地区制药企业的联系，与企业一线生产人员共同探讨课程教学内容。
教学方法探索 在教学方法上，我们依据高职类学生文化基础、思维特征，针对不同的具体内容选择采取了项目教学法及案例导入法等多种“教学做合一”的形式开展教学，从而实现了将过去以教室为中心的学习形式向以实验室工作过程为中心和“边教、边学、边做”形式的过渡。例如，将基础知识部分组织成多个承前启后的项目，微生物应用部分（如微生物与发酵、食用菌栽培与药品的微生物污染检测等）采用案例法组织教学。通过启发与讨论、理论密切联系实际等方法引导学生加深对所学知识的运用、提高学习的兴趣与积极性。提供适量学时，鼓励有积极性的学生自选教学内容，采取合作或独立查阅资料和制作多媒体课件进行授课的形式实现了师生主体角色的转换，从而使学习以形成综合能力为目的而非单纯的知识摄取。同时鼓励学生在实验教师的指导下，根据自身兴趣进行微生物实验的设计与操作。
在有了一定的手段与方法基础上，我们认为利用适当的幽默或英文等教学技巧也是提高教学效果的良策。比如在要求学生列举已知的病毒时“特意提醒”不要自作聪明地制造“人瘟病毒”。在课堂中偶尔适时地穿插一个英语单词或简单的句子能够起到很好的调节作用，往往能让喜欢或不喜欢英语的学生激发兴趣。
（二）认真整合教学内容
内容的选取与组织 2007年下半年，在长期从事企业生产实践的“双师型”教师共同参与下，我们编写出了一本较为符合当前高职教育理念的湖北省“十一五”规划教材——《微生物及其应用》并获2009年湖北省高职高专优秀规划教材奖。本教材根据当前高职院校生物制药专业的培养目标及湖北省示范院校生物制药专业人才培养方案建设要求建立课程教学标准与内容，按照“教学做合一”模式进行教学内容的合理融合。在内容的组织上充分考虑高职学生的文化基础与思维习惯，适当降低了理论知识部分的深度，强化了微生物在生产实践中的应用。将课程内容按照微生物由大到小、由表及里的原则进行重新组合，首先使学生通过显微镜对各种微生物进行最基本的感性认识，然后逐渐了解微生物的培养技术及其在生产中的应用，从而顺其自然地完成对整个微生物课程内容由感知到认知的知识延伸与拓展过程。
教学组织与实践 为了较好地落实高职教育所推崇的“边做边学，边学边练”行动导向的教学理念，我们采取的是理论与相应实践操作（单元实验）相互融合的模式开展教学，并将教学内容划分为“基本知识与技能”和“知识与能力运用”两大模块，其中包含了“微生物形态观察技术”、“微生物分布与生长控制技术”及“微生物应用与检测技术”三个单元与七个项目来实施教学。在此基础上，我们还开发了《微生物及其应用》院级精品课，并在教学中认真践行“边做边学，边学边练”的教学方法，使学生能够自觉地将所学知识与实践相结合，从而既增强了学生学习的主动性，同时又较好地锻炼了他们的动手能力，强化了教学效果。
重视第一次课设计 第一次课是一门课程的序曲，它是引导学生进入微观世界、激发学生求知欲望、增强课程魅力的最佳向导。本课程的第一次课是通过“一个富有创造和启迪性的故事（列文虎克）”、“多幅彩色动静态图片的展示”和“一系列惊人的数字”等具有鲜明特色和感性认识的内容逐步展开的，非常强烈的视觉效果让学生产生了对微生物的浓厚兴趣，进而较好地激发了他们对本课程的学习热情和探究心理，当然也取得了非常好的教学效果。
（三）强化实践教学与考核
加大实践教学比例 本课程的教学目的是为后续的职业技术课程学习与生产实践打下良好基础，满足生物制药生产、建设、管理和服务第一线的技术应用型人才对微生物知识与技能的需要，同时培养学生创新精神和创业能力。因此，我们按照“教学做合一”的模式将理论知识与有关实验内容进行了有机融合，因而也在很大程度上减少了理论学时，相应增加了实验操作学时，使理论与实践学时之比将近1∶1。将课程的实验分为平时的单元实验、期末整周的综合实训、培养兴趣的自主实验（如对口腔、霉变水果中微生物进行分离培养等）几项，并着重培养学生的无菌操作技能和微生物实验安全意识。
改革实践考核制度 在对本课程教学模式进行探索与实践的同时，我们对其考试制度也进行了改革。改变了传统的以理论为主、实验为辅的考试为理论考试和实验操作考核并重的新型综合考试制度。使实验成绩与理论成绩之比达到1∶1，其中实验考核以实践操作为主，口试、笔试为辅。同时，坚持平时表现与考试考核并举的形式对学生进行知识、能力和素质等方面的综合评价，即按照平时考勤、提问和作业成绩占总成绩20％、理论考试和实验成绩（包括实验操作考核、实验课表现、实验报告等）各占40％的分配比例进行课程成绩的综合评定，从而使本课程的成绩考核既符合高职以过程为导向的课程观和以行动为导向的教学观，又实现了考试过程的全程化和考试手段的多元化；既增加了考试的灵活性，又调动了学生实践操作的积极性，取得了较好的教学效果。
在2008年和2009年由教育部高等学校高职高专生物技术类专业教学指导委员会组织的两届生物技能大赛活动中（含微生物操作技能竞赛），我院生物制药专业的学生分别获得了团体一等奖一项、个人一等奖二项、二等奖和三等奖各一项的好成绩。
