发布时间：2022-05-31 14:54:08
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的离职感谢信样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
你好！你好！
首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感谢！首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感谢！感谢你在公司任职期间的兢表示感谢兢业业、默默奉献！感谢你对____的认可与信赖！感谢你对____的忠诚和敬业！感兢业业、默默奉献！的认可与信赖！的忠诚和敬业！付出的辛勤和汗水！谢你对____付出的辛勤和汗水！
可能是因为公司平台及发展方向与你个人对未来规划暂时不能保持一致，可能是因为公司平台及发展方向与你个人对未来规划暂时不能保持一致，而让你选择离开你曾为之奋斗的工作岗位。但是我们相信，离开你曾为之奋斗的工作岗位。但是我们相信，在____这些日子的成长能让你比昨天更自信、朋友更多、笑容更美！在未来的日子里，因为你的努力拼搏、自信、朋友更多、笑容更美！在未来的日子里，因为你的努力拼搏、踏实肯干的精神让你在任何岗位都能成就不平凡的事业，无论是在工作中或生活中，你都是最优秀的！在任何岗位都能成就不平凡的事业，无论是在工作中或生活中，你都是最优秀的！
作中或生活中优秀员工是企业的财富，当你决定离开时，我们的心里都有一种说不出的感受-----优秀员工是企业的财富，当你决定离开时，我们的心里都有一种说不出的感受-----是遗憾！是惋惜！是祝福！但是天下没有不散的筵席，我们衷心祝福你：家庭和睦，是遗憾！是惋惜！是祝福！但是天下没有不散的筵席，我们衷心祝福你：家庭和睦，健康幸福！同时请你记住：公司全体伙伴非常高兴地欢迎你有时间常回家看看，幸福！同时请你记住：公司全体伙伴非常高兴地欢迎你有时间常回家看看，希望你能把当成你永远的“娘家”____当成你永远的“娘家”！
再次向你和你的家人表示真挚的感谢和深深的祝福！再次向你和你的家人表示真挚的感谢和深深的祝福！此致敬礼
你好！
你在公司服务整整一年，一年，就漫长的人类世界来说，也许只是短暂的一瞬，但就个人而言，也算不短的岁月。
在你提出离职的那一刻，我有种酸酸的感觉，毕竟，我不只一次跟你们说，大家一起努力，共同退休。
但你因为个人发展，在劳动合同到期的那一天，选择离开服务过365天的潇湘文化，真有一种说不出的滋味。
就设计能力而言，你并不占优势，但你忠厚坦诚、任劳任怨，在这物欲横流的社会，是难得的美德。所以，我一直非常喜欢你。
不知你以后会做些什么，希望以你的美德去感染更多愿意支持与帮助你的人，焉知，人格魅力才是人生发展最大的锐器。
你已经离开公司了，我将这封迟到的感谢信发给你哥哥，希望他转交给你，真诚感谢你为公司所做的艰辛付出，潇湘文化永远不会忘记你的功劳。方便的时候，常回“家”看看。
谨祝
事业有成、幸福平安！
小__：
当得知你由于诸多的个人原因不得不选择离开公司时，做为总经理，我心里有一种说不清的感受——是遗憾，是惋惜，是祝福？我想三者都有！
做为一名老员工，你在公司工作了三年半，伴随着企业走过了许多风雨。三年半来，你从一名普通员工成长为一名称职的基层管理人员和优秀员工，这里面有企业为你创造的条件和机会，更有你自己辛勤的努力和付出。为什么能从一名普通员工成长为优秀员工？正如你说的那样：“每天都想着把每一件事做好，认真关注每一个细节”，承担责任，默默地为企业奉献。在此，我代表公司向你致以诚挚的谢意！感谢你对企业的认可和信赖！感谢你对企业的忠诚和敬业！感谢你为企业付出的辛劳和汗水！感谢你让自己的青春在××公司闪光！
大家好!今天我怀着依依不舍的心情写下这封信，俗话说：人生没有不散的宴席。今天选择离开这个我生活与工作了五年的地方，并不是因为公司给予我的太少，也不是待遇问题。回顾五年，公司给予我的实在是太多太多，自己在公司也尽了自己微薄的力量。选择离开是觉得在公司这个美好的平台上，自己就像是温室里的花朵，必须到外面经历风雨才能茁壮成长，也许会碰得头破血流，但也是人生中的一段精彩的回忆。
首先非常感谢公司给了我一个很好的工作平台，以及在职的五年里对我的栽培和关怀，让我在任何时候内心都洋溢着感激之情，我从毕业来到新邦，作为新邦发展壮大的见证人，内心无比的骄傲，一路走来，收获了太多太多，都是新邦给我的，但是由于个人原因，不能为公司辉煌的明天继续贡献自己微薄的力量，为此感到深深的歉意。
在职的这些时间里，我从一个懵懂少年学会了物流的专业知识，学会了客户谈判、学会了管理技能，公司给予了我实现自身价值的机会，使我不断的成长，积累了工作的经验，学会了为人处世的道理，所有的这些都是我所珍惜的，带给我工作和生活中很大的帮助，感恩新邦，感谢石总、感谢袁总、感谢杨总、感谢程总、感谢艾总、感谢梁总、感谢吕总，感谢所有帮助与支持过我的同事和朋友。
在新邦的日子是充实而且快乐的，与优秀的新邦人成为同事，一起共事，让我受益匪浅，并且也将深深的影响我，我诚挚的感谢大家，因为你们让我成长，成熟，在朝夕相处的时间里建立的深深的友谊，是我一辈子的财富。
千言万语还是一句感谢，感谢过去的五年新邦给予我的栽培，感谢领导给我的帮助，感谢同事给我的支持。衷心的祝福公司的规模不断的扩大，业绩不断的提升，祝愿公司领导以及各位同事工作顺利，生活愉快!
说来也奇怪，每个月我拿到杂志的第一件事，不是像其他同学一样先看笑话或是美文，而总是一本正经地研究起“封面人物”来，顺便把自己和他们作一番比较：这个姑娘腿好长，我也是大长腿呀；这个姑娘好美，我的颜值也能入大家法眼吧；这个帅哥成绩真好，我的成绩也不赖……不知道为什么，对于封面人物，我总是有一种既佩服又不服的心理。
直到某期封面上刊登了一个我们衢州的姑娘时，我第一次有一种原来自己离封面人物那么近的感觉。我终于按捺不住内心的“洪荒之力”，鼓起勇气把自己的照片放上了锐角网。
头几天，每天回家我都会打开电脑，看看有没有人评论。“刚开始看的人不多，很正常。”我这样安慰自己。又过了几天，有消息提示跳出来，我心里一阵狂喜，是不是有人来为我加油了，还是小编看到我了？我迫不及待地点开了页面，回复不多，当中却夹杂着好几条负面评论。我的心情一下子从云端坠入了谷底。虽说“胜败乃兵家常事”，但我还是有一些失落。从那之后，我便没有登录过锐角网了。
直到有一天。“侬侬，你把照片放到网上去了？”妈妈接完一个电话后疑惑地问我，“《中学生天地》的编辑说你成功入选封面人物了，这是不是真的？”
真的真的！我激动极了，赶紧跟爸妈解释这件事情的前因后果，妈妈终于相信了她女儿的魅力，还神神秘秘地跟我说了件事，可把我逗乐了――原来《中学生天地》的编辑在打电话之前就发过一条短信，但谨慎的妈妈竟然直接把它当成了诈骗短信。而我爸爸是个特别爱N瑟而且自恋的人，这一点我可能有点随他。他的反应与妈妈完全不同，简直是高兴得不要不要的，就差没当天晚上就把我送去拍照了。
拍摄那天是1月31日，日子我记得很清楚，因为那天刚好也是我八年级上的休业式，我果断跟老师请了假，老师也果断准了。
一路上我都特别悠闲自在地躺在车后座，还眯了一小会儿，然而快到拍摄的地方时，我突然开始坐立不安了。摄影师朝我走过来的时候，是我最最紧张的时刻。他先是笑着的，然后突然皱起了眉头，短短的一两秒钟，我却觉得特别漫长，然后就听到他十分忧伤地说：“你怎么那么高啊？你妈妈说你只有1米55呀，哎呀，那我买的衣服你穿不下怎么办？”后来才知道，他这么说只是为了缓解我的紧张。摄影师的形象瞬间从“高冷艺术家”直接降到了“唠叨欧吉桑”。
那天，天特别冷（回家的路上还下起了雪），而我要穿着和三月号封面相符的春天的衣服，在凛冽寒风中，摆出各种pose，脸上表情还不能太僵硬。虽然我很机智地在身上贴了好几个暖宝宝，但还是要靠跺脚和搓手来取暖，瞬间有点同情起大冬天走红毯的女明星们。
刚开始拍摄的时候还有点紧张，手不知道该怎么摆，眼睛不知道该看哪儿，不过摄影师叔叔很专业，他一直在调动我的情绪，还亲自示范摆姿势。拍着拍着，摄影师突然跟我说：“好的，很好，你把刚才的动作再做一遍。”下一秒，大家就都笑趴在了地上――我以为摄影师要我半眯着眼去看放大镜，还想这么丑的表情真的好看吗。据我妈妈的描述，当时的画面就像是一个中年大叔很努力地把眼睛眯起来，要看清楚路边的美女一样，特猥琐。一阵笑声过后，我变得放松多了。
那期杂志社策划的选题是“教室里的福尔摩斯”，衣服的搭配很有名侦探范儿，特别酷。后来又换了一套红黑格子裙，化妆师姐姐还帮我换了一个发型，我可算是好好地过了一把模特瘾！
每一时间点都巧合地让“上封面”这件事给我留下难以磨灭的印象，就像是休业式那天请假去拍摄，又比如期中考试出成绩的那天拿到了三月号杂志。
你们好!
凝聚岁月，四个月多的顶岗支教实习时间悄然从指间划过如白驹过隙。初来时，还是咋暖还寒的二月，可离别之时已是烈日炎炎的六月。至此，回想起来这一切的一切就好像是昨天刚发生的事一样。
回望当时来XX中学时，一切都是未知的，对自己将来在这里一学期的生活、工作具体那么多的不确定。担心不能很好地适应智力的高中生活;担心学校不会给我们安排上课以及自己生活上的问题，总之一切的一切都处在担心之中。后来证明我们担心地这一切都不从在。虽然达到时是寒冷的二月，但到达XX一后，就有老师带领去熟悉宿舍以及我们的生活问题也得到了解决，可以说初来时的一切都很顺利，也让我们感到温暖。
接着给我们介绍了两位指导老师，也就是我的两位师父，刘老师与郝老师。虽然第一次见面，但总觉得我的师父是那么的和蔼可亲。刘老师是一个细心的人不仅仅对我的教学进行指导，更是对我们的生活无微不至的关怀。郝老师是一位知识渊博，有幽默感的老师。总之，这四个多月的实习过程中两位师父总是不忘关心我们在生活当中有什么难处。除此之外，刚开始以为我们是实习老师，办公室里的其他老师会冷漠我们，可事实刚好相反，办公室里的老师非常友好，而且他们也多次地帮助我们。再次，只能用自己绵薄的语言给他们说一声谢谢。
【关键词】 产后出血；子宫摘除；护理；心理干预
【中图分类号】R635 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)06-0115-01
胎儿娩出后24小时内出血量超过500ml者称产后出血。产后出血是分娩晚期严重并发症，至今仍居我国孕产妇死亡原因的首位[1]。对产科不可控制的出血，适时切除子宫是抢救产妇生命最重要的手段，但对产妇的心理健康会有一定的影响，应积极的进行心理干预和支持。现将我院2010年收住的一名患者因产后出血经各种方法处理无效，最后行子宫切除的病例进行回顾性分析，患者经术中、术后心理干预措施和积极有效护理获得痊愈，现将护理体会报告如下。
1 临床资料
1.1一般资料：患者：女，28岁，经产妇，两年前产一子，剖宫产。今孕周39周，胎儿巨大，5.3kg，宫缩乏力。
1.2 手术方式：剖宫产术后即行子宫切除术。
1.3 出血量及输血量：手术出血量2000毫升，输血1600毫升。
1.4 结果：住院13天，切口愈合良好，痊愈出院。
2 护理
2.1 抢救与护理:产后出血会在短时间内失去大量血液，造成产妇血容量不足，迅速进入休克、DIC，甚至发生不可逆的器质性损害，所以抢救必须争分夺秒。
2.1.1 建立静脉通道:积极配合医生快速建立静脉输液通道3条，以便输液、输血。静脉穿刺选择20号针头(用三通管套管针)。给予输液输血，补充血容量，力争在1～4小时改善微循环，保证重要器官的供血，补充凝血因子，防治DIC。
2.1.2 防止脑缺氧:产妇取平卧位，保证脑部供血，正压输氧，减轻脑水肿，防止脑缺氧。保持呼吸道通畅，做好口腔护理，预防呼吸道感染。
2.1.3 持续监测产妇的生命体征，测定中心静脉压，指导输液。
在止血及补充血容量的同时，积极查找出血原因，正确使用宫缩剂，及时给予止血药物，根据出血的不同原因，做好相应的处理和护理。注意保暖(最好不使用热水袋)，正确记录尿量，遵医嘱准确及时静滴肝素并维持一定血药浓度。做好各项抢救护理记录。术中严密观察生命体征变化，保证静脉通道通畅。
2.1.4 心理护理:术中鼓励、安慰患者，给予心理支持，使患者主动配合治疗。
2.2 术后护理:
2.2.1 术后继续严密观察生命体征的变化，做好特护记录。
体温>39 ℃予以降温，冷敷或洒精擦浴，以减少耗氧量。同时，保持尿道通畅，防止管脱落、变压、扭曲，观察尿量、颜色及性质。患者阴道流血情况在切除宫体后逐渐好转。加强基础护理，保持病房环境安静舒适，积极协助患者变换，预防腹部手术后肠粘连、肠梗阻的发生。
2.2.2 心理干预:产后失血的强烈刺激，抢救措施的频繁而紧急，各种抢救仪器的使用，加之医务人员之间严肃的神情，失去子宫所面临的诸多问题，这些突况易使患者惑到自已面临死亡的威胁，进而产生恐惧、紧张、频躁不安的心理。在护理中尽量做到有一名护士始终伴随左右，及时告知她有关信息。并且医护人员保持镇静的工作态度，忙而不乱，注意保护性医疗措施以稳定患者情绪。待子宫切除的手术做完，病情稳定后，患者往往会因失去子宫而暗自饮泣，流露出今后的路该怎么走的抑郁趋向。护士应该敏锐地意识到患者的情绪变化，对其动之以情、晓之以理，让其比较生命与子宫谁更重要。同时，护士应该做好家属的心理护理，要求他们协助医护人员做好患者的心理支持。患者家属对患者体现了无微不至的关怀，患者未出现心理问题。
3 讨论
3.1 产后出血致子宫切除患者的心理特点及干预:由于患者年龄小，对手术的方法、安全程度及对手术的后果不了解，使其很容易产生恐惧的心理 。同时，有些患者会担心术后不能再生育会导致夫妻感情的破裂。也有部分患者性格偏内向，对医学知识有所了解，但并不完全准确，故思想负担过重。因此，积极的心理干预就显得尤为重要。术前，应做好患者的思想工作，解除手术的种种顾虑，积极给予安慰，消除患者紧张恐惧和不安的情绪。另外，患者家属的情绪会直接影响患者的情绪，故不仅要让家属克制悲观情绪，而且要指导他们对患者进行心理安慰，这是能稳定患者的心理变化的重要环节。术后要实行保护性治疗措施，以免患者过于紧张。对病情要给予科学的解释，做好心理安慰和思想工作。
3.2 产后出血致子宫切除患者的护理:产后出血的预后随失血量、失血速度及产妇体质不同而异。严密观察病情，对产后出血致子宫切除的患者应准确计算其失血量，包括沙布、棉垫、手术单，引流瓶中的血液量等。同时，将贮血盆垫于产妇臀下以计算阴道失血量。密切观察患者生命体征的变化，发现有心率加快，血压下降，手足湿冷等休克前期的症状及时通知医生，为医师的诊治提供第一手资料。由于患者存在出血多，创伤大、营养失调、贫血等情况，应给予饮食指导，以期患者尽快恢复体力。嘱患者术后2个月内避免提举重物，避免从事增加盆腔充血的活动。1个月内避免阴道冲洗和性生活，以免影响阴道残端的愈合，引起感染。遵医嘱如期返院复查，若出现阴道出血，异常分泄物更应及时回院检查。
参考文献
关键词：心理护理干预;机械通气;气管插管
神经内科临床常见很多病情极其危重的患者，这些患者病情发展快，危害性大，患者常伴有呼吸无力，精神萎靡，痰液粘黏不易咳出的临床表现，临床常应用机械通气进行缓解患者的临床症状，但是在实际应用中，进行长时间使用机械通气的患者常会出现，舒适感降低，内心十分恐慌以及紧张焦虑的表现，在临床上应用心理护理干预的方法对患者的治疗有很大的促进作用[1]。本文选取我院自2012年1月~2013年6月，进行门诊收治入院的患者病例，对所有患者进行心理护理干预，并于干预前后进行心理状态的对比分析。
1资料与方法
1.1一般资料选取我院自2012年1月~2013年6月进行门诊收治入院的患者病例90例，对所有患者进行心理护理干预。其中男47例，女43例，患者的年龄43~79岁，平均年龄是(38.4±11.3)岁，患者的机械通气平均时间是(4.28±6.34)d,患者的性别、年龄和病因上的比较无统计学意义。
1.2方法临床表现呼吸困难，痰多，粘稠的患者给予及时叩背、吸痰及其面罩吸氧的应用。
当患者氧分压80mmhg时，出现中枢神经损伤、外周循环衰竭在呼吸机上潮气量（VT）的设定标准是8~10ml/kg。呼吸频率（RR）设置是12~18次/min，吸入气氧浓度(FiO2)，常选用30%，对患者缺氧状况的改善情况根据血氧分压来进行调节；对于极危型的患者给予紧急采取气管切开造口通气，常选择的位置在第3、4软骨环，于颈部进行皮切开插管，将套管插入气管，这样患者能经套管进行呼吸。
1.3心理护理干预方式
1.3.1焦虑感的护理干预进行机械通气的患者其情绪波动较大，人工气道的建立给患者带来极大的不适感对患者的影响很大，此时患者多存在情绪不安，焦虑、烦躁的思想，需要护理人与患者进行交谈，给予患者关心与爱护，尊重和理解患者的心情。
1.3.2自卑感的护理干预在进行人工通气的患者，大部分内心都会有着自卑的心理，护士应该对其心理状况做出及的了解，让患者明白机械通气对她们的生活与生命并不会受到很大的干预与影响，尽量减轻和消除患者的自卑心理。
1.3.3恐慌感的护理干预很多进行造口术通气的患者，他们都会存在恐慌的心理，因为自身呼吸功能受损，不能有效的进行自主呼吸，身体无力感和精神萎靡感让他们有种即将走向死亡的恐惧感觉。护理人员应该针对患者在机械通气后出现的恐慌感，进行有效的评估，并相对应的进行合理的解释，减轻患者对身体治疗的恐慌[2]。
1.3.4紧张感的护理干预进行气管插管的患者，身旁总会有很多大小型的机器设备和导管的链接，呼吸机仪器上面的数字标注和警报灯的相应，同时还有医护及时性的来回访视和记录，这不由自主的给患者带来一种紧张的气氛，他们认为这种环境是处于高度集中和压抑的，导致患者产生高度烦躁、紧张心理。对于这样情况下的患者，护理人员应该给与细心的观察与呵护，防止患者因为环境和气氛的原因，对治疗情况产生影响。
1.4观察指标在给予患者心理护理干预前后进行比较，观察患者的临床心理状况，给予患者自行评估表的形式，进行评估其焦虑感、自卑感、恐慌感、紧张感的表现。
1.5统计学方法以SPSS18.0软件包对数据进行统计分析。计量资料数据以(x±s)表示，以t进行检验。P＜0.05表示两组间的差异有统计学意义。
2结果
比较分析患者护理前后的心理状况，在对患者进行有效的心理干预后， 给予患者自行评估表的形式，进行评价，结果显示患者存在的心理状态分别是,干预前:焦虑感33例(36.67%),自卑感21例(23.33%)，恐慌感19例(21.11%),紧张感 17例 (18.89% )；干预后：焦虑感3例(3.33%)，自卑感4例(4.44%)，恐慌感2例(2.22%)，紧张感2例 (2.22%)，心理护理干预后的患者的心理状态明显好于干预前，前后比较有显著性差异(P
3讨论
由于神内科机械通气患者的特殊性，有效的心理护理干预模式显得很重要，在操作过程中需要给予患者悉心的关照与呵护，给予患者的相关疾病的教育，理解和支持患者。给予患者及家属讲解关于通气设置的作用和功能，告诫他们良好的心态对疾病的治疗与康复有很好的促进作用，让他们认识到心态对疾病预后的重要性[3]。
护理人员需要及时为患者排除心理焦虑与紧张，给予患者更多的心理安慰，与患者平易相处，走进他们内心，让他们感觉医护人员就是他们的知己，同时告诉患者家属对患者要有耐心的态度与亲切的关心，让患者感受到家人对他们的爱。通过有效的心理护理干预模式，用开导和鼓励的方式促进患者的康复，让患者感觉到温暖和自信，真正感受到自己的价值和意义，促进疾病的快速康复。
参考文献:
[1]陈爱萍，蔡虻.ICU患者非计划性拔管及相关研究进展[J].中华护理杂志，2007，42(10)：934-937.
2003年11月－2005年9月，笔者应用柴蒲泻心汤治疗幽门螺杆菌(HP)相关性消化性溃疡 65例，并与含质子泵抑制剂奥美拉唑的三联疗法作对照，取得良好疗效，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 入选病例标准
年龄18～65岁，入选前2 d内镜检查证实有胃或十二指肠单一、多发复合性溃疡，溃疡直径大于3 mm，溃疡分期为活动期(A期)[1]，HP现症感染(组织学、胃活检尿素酶试验)阳性。
1.2 排除病例标准
胃镜证实非活动性溃疡、活动性出血、幽门梗阻；病理证实胃溃疡有可疑及恶变者；经实验室、B超、X线、CT、心电图等检查有心、肺、肝、胆、胰、肾等严重器质性疾病者；治疗前2个月应用西药抑酸、抗HP及保护胃黏膜药物治疗者。
1.3 一般资料
所有病例均为本院住院患者，符合入选标准的病例共128例，随机分为2组。治疗组65例，男46例，女19例；年龄20～65岁，平均(41.3±11.5)岁；病程最长31年，最短6个月，平均(5.24±2.25)年；胃溃疡20例，十二指肠溃疡42例，胃、十二指肠复合性溃疡3例。对照组63例，男44例，女19例；年龄18～65岁，平均(40.5±12.7)岁；病程最长32年，最短7个月，平均(4.95±2.14)年；胃溃疡19例，十二指肠溃疡41例，胃、十二指肠复合性溃疡3例。2组年龄、性别、病程、溃疡类型、主要症状(上腹痛、反酸、腹胀、嗳气、纳差、恶心等)经统计学处理，差异无显著性意义(P>0.05)。
1.4 治疗方法
治疗组用柴蒲泻心汤：柴胡10 g，蒲公英30 g，黄芩10 g，黄连9 g，大黄10 g，延胡索10 g，丹参30 g，白及10 g，乌贼骨30 g，白芍10 g，党参15 g，白术15 g，茯苓30 g，枳壳10 g，甘草6 g。水煎服，每日1剂，早晚各服1次，连服4周。对照组用含质子泵抑制剂奥美拉唑的三联疗法：奥美拉唑肠溶片(山东新时代药业有限公司生产，批号050203)20 mg，口服，每日1次，连服4周；阿莫西林胶囊(哈药集团三精明水药业有限公司生产，批号0509219)1.0 g；甲硝唑片(山东博山制药有限公司生产，批号010003)0.4 g，口服。均每日2次，连服1周。2组均以4周为1个疗程。
1.5 观察指标与方法
患者于治疗前及疗程结束4周后进行胃镜检查与HP检测，并详细记录症状、体征变化情况，进行评分，评分标准见表1。在治疗过程中，如患者出现腹痛、反酸等症状，随时复查胃镜。表1 胃肠道症状评分标准（略）
1.6 疗效标准
1.6.1 临床症状疗效评定标准
显效：临床积分消失，或症状积分减少>75%；有效：临床积分改善，或症状积分减少为50%～75%；无效：临床症状无好转或加重，或症状积分减少
1.6.2 溃疡疗效评定标准
依据中华人民共和国卫生部药政局1988年制定的疗效评定标准评定[2]。愈合：溃疡及周围炎症全部消失；显效：溃疡消失，仍有炎症；有效：溃疡面积缩小50%以上；无效：溃疡面缩小不及50%。
1.6.3 HP根除标准
疗程结束4周后复查组织学、快速尿素酶试验，如两项为阴性，则为根除，如1项或2项为阳性或弱阳性，则表示未根除。
1.7 统计学方法
计量资料用t检验；计数资料用χ2检验和Ridit分析。
2 结果
2.1 2组临床症状疗效比较
(见表2)表2 2组患者临床症状疗效比较[例(略)]注：2组比较，P>0.05。
2.2 2组治疗前后主要症状积分比较
治疗后2组在胃脘痛、返酸的改善方面与治疗前比较，差异均有显著性意义(P
2.3 2组溃疡愈合情况
(见表4)表4 2组患者溃疡病灶愈合情况比较[例(略)]注：2组各型溃疡的愈合率及总有效率比较，P>0.05。
2.4 HP根除情况
治疗组65例，HP根除55例(84.6%)；对照组63例，HP根除52例(82.5%)。2组比较差异无显著性(P>0.05)。
2.5 不良反应
治疗组未见任何不良反应，对照组有23例发生不良反应(36.5%)，其中恶心8例，头晕3例，皮疹3例，便秘3例，口干2例，口中金属味2例，谷丙转氨酶轻度升高2例。
3 讨论
HP是消化性溃疡发生的最重要致病因子之一[3]。通过根治HP促使溃疡愈合并防止复发的尝试越来越受到关注。含质子泵抑制剂如奥美拉唑的三联疗法是目前应用较多的根除HP有效方案之一，但由于其治疗存在一定的不良反应，故治疗依从性较差。近年来由于抗生素的广泛使用，普遍存在HP耐药菌株增多的问题，如对甲硝唑耐药发生率美国为24%～70%，韩国为95%，中国部分地区为30%～60%，对克拉霉素耐药率约为20%[4]。因此，进一步寻找对HP敏感的药物已成为临床迫切的任务。
消化性溃疡属于中医“胃脘痛”范畴。中医认为，脾胃内伤、脾失健运是本病发病的内因，外感六、内伤七情及饮食劳倦失调等是发病的外邪攻击因素，内外因结合导致脾胃运化失司，升降失调，气滞血瘀，湿热蕴结，气血不调，胃膜不生而发病。临床上，HP相关性消化性溃疡以脾胃湿热型多见，其次为气滞血瘀、脾胃虚弱型。柴蒲泻心汤方中蒲公英甘苦寒，清热化湿、解毒消痈；黄连、黄芩清热化湿；延胡索、丹参活血化瘀、通络止痛；白及、乌贼骨制酸敛疡、去腐生肌、护膜止痛；柴胡、枳壳、白芍、甘草(四逆散)以疏肝理气、理脾和胃；大黄消满除胀、下瘀止痛；党参、白术、茯苓益气健脾渗湿，补中焦脾胃之气，以使“正气存内，邪不可干”。全方共奏清热化湿、制酸止痛、理气和血、健脾和胃之效。
现代研究表明，黄连、黄芩、延胡索、丹参、甘草等对HP有直接杀灭作用[5]；蒲公英对HP有抑杀作用，并对损伤的胃黏膜有保护作用；柴胡能调节下丘脑-植物神经功能，党参可提高机体免疫功能[6]，二药合用，通过调节神经免疫网络扶正固本而消炎。现代药理研究结果表明，大黄中4种蒽醌化合物除大黄酚有止血作用外，其余均具有抗菌作用，且4种大黄蒽醌化合物皆对HP有较强的抑制生长作用。最近的研究又发现原先认为无抗菌作用的某些成分(如大黄酚)对HP的生长亦有抑制作用[7]。此外，大黄还对胃肠黏膜有明显的保护作用，并能改善应激性胃肠黏膜病变的血流灌注[8]。因此，该方可能通过抑制胃酸分泌、抑杀HP、改善胃黏膜血流量、增强胃黏膜的屏障功能、促进溃疡愈合来达到治疗目的。
【参考文献】
[1] 李益农，陆星华.消化内镜学[M].北京：科学出版社，1996.227－228.
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【摘要】 人工构建镉盐污染源，选用差速离心结合双向凝胶电泳（2DPAGE）法，高效提取、分离和筛选牙鲆（Paralichthys olivaceus， PO）受镉盐胁迫后的肝脏全蛋白和差异蛋白质。实验结果表明: 选用直接裂解法提取牙鲆肝（PO liver POL）全蛋白质且用2DPAGE分离，可获得约800个蛋白斑点，其中镉盐诱导了11个差异蛋白斑点。以相对离心力为1000×g、12000×g和100000 ×g 的差速离心法，分别制备了3种沉淀蛋白和1种胞浆蛋白，称为POL组分Ⅰ、POL组分Ⅱ、POL组分Ⅲ和POL组分Ⅳ（胞浆蛋白），蛋白斑点数目分别为380、550、500和850个，总计2280个，明显高于直接裂解法。比较分析法发现，差速离心结合2DPAGE分离技术可获得牙鲆肝脏受镉盐胁迫后表达的54个差异蛋白质，并适合于用肽质量指纹(peptide mass fingerprint，PMF)图谱技术鉴定。本实验所建立的差速离心结合蛋白质组学技术可高效提取、分离和鉴定组织全蛋白或差异蛋白，并能有效地筛选出蛋白指示物。
【关键词】 牙鲆肝，蛋白质组学，差速离心，镉污染，蛋白指示物
Abstract Both total proteome and differential proteins were effectively extracted， separated and selected by a combined approach of both differential centrifugation and 2DPAGE in liver of Paralichtys olivaceus( POL) under the stress of cadmium chloride as an artificial pollution source. Approximately 800 spots for extraction of whole protein separated with 2DPAGE were obtained by direct lysis in the POL. In addition， approximately 11 differential proteins in POL were also obtained under the stress of cadmium chloride. The differential centrifugal were used to prepare three sedimentation and a plasmolysis proteins， called POL component Ⅰ， POL component Ⅱ， POL component Ⅲ， and POL component Ⅳ(plasmolysis protein)， respectively. Total protein spots for each gel were calculated to have 380， 550， 500， and 850， respectively， approximately 2280 spots in sum， while total spots are much higher than those by direct lysis approach. Using the comparison method， approximately 54 differential proteins in POL were obtained by a combined technology of both differential and two dimensional polyacylaminde gel electrophoresis(2DPAGE) methods under the stress of cadmium chloride. In addition， these differential proteins can be further identified by peptide mass fingerprint(PMF). Here， these combined techniques can be effectively used to extract， separate and identify the whole proteins and the differential proteins including protein markers in the biological tissue.
Keywords Paralichthys olivaceus liver， proteomics， differential centrifugation， cadmium contamination， protein marker.
1 引 言
建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白，且可鉴定蛋白质的方法，是目前开展蛋白质组学研究所面临的技术难题之一[1，2]。双向凝胶电泳（2DPAGE）和双向液相色谱分离（2DLC）技术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术，但前者易受细胞组织内干扰物影响，例如核酸、多糖和脂类物质[3]；而后者在分离过程中，易丢失部分蛋白质，难获取全蛋白[4]。目前，组织细胞全蛋白的常用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等[1～4]。针对生物材料来源不同，优化提取组织细胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今，相关的研究已有大量且详细的研究报道[5，6]，但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一，相关的研究仅仅处于起步阶段。环境蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物，在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的多种蛋白指示物[7，8]，为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据[1，2，9]。
本实验以牙鲆肝脏组织为材料，选用差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术，高效提取和优化分离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白，为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
双向电泳仪(北京六一仪器厂)；REFLEX 型MALDITOF质谱仪（德国Bruker公司）；各类冷冻离心机（贝克曼公司）。载体两性电解质（Amersham公司），pH 3～10；胰蛋白酶(Promega公司)；基质α氰4羟肉桂酸（美国ICN生物医学公司）;碘乙酰胺(Sigma 公司)；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等试剂均购自上海生物工程技术有限公司；匀浆缓冲液：0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L PMSF (pH=7.4)；样品裂解液：7 mol/L 尿素，4% CHAPS，2 mol/L 硫脲，60 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.5% 载体两性电解质，0.0002% 溴酚兰。分装，－20 ℃保存待用；双向电泳和银染方法中所需试剂均参考文献[1，10]。
实验所需的牙鲆均购于厦门人工养殖场。使用前，牙鲆需在实验室驯养一周。实验前72 h开始停止喂食，防止饲料中微量重金属影响牙鲆的正常代谢。随机选择牙鲆10只，并随机分为实验组和对照组。实验组牙鲆置于人工模拟构建的CdCl2（10 mg/L）的污染环境中，继续饲养72 h。对照组牙鲆置于在人工海水中继续饲养。实验前，选用剪断脊椎处死方式处理牙鲆，并迅速解剖，获取牙鲆肝脏，用预冷的磷酸盐缓冲液直接冲洗，并保存在－80 ℃以备使用。
2.2 差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质
取实验组（受镉盐胁迫）5条牙鲆的肝脏（POL）各20 g，混合后共100 g。对照组的POL取法同上。加入等体积匀浆缓冲液，在冰浴条件下研磨制成匀浆。随后，以 400×g 的相对离心力离心10 min，去除未磨碎的组织和细胞，收集上清液Ⅰ，备用。选用下列差速离心技术，分步收集蛋白沉淀物，并选用2DPAGE进行有效分离，具体实验步骤（始终维持在4 ℃环境下）：（1）1000×g 沉淀分离：以1000×g 的相对离心力离心上清液Ⅰ10 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。该沉淀物主要是细胞核，用匀浆缓冲液洗涤两次，最后收集沉淀样品备用（－20 ℃保存，下同）；（2）12000×g 沉淀的分离：以12000×g的相对离心力离心上清液Ⅱ 30 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。选用匀浆缓冲液洗涤该沉淀蛋白两次，最后收集沉淀样品备用；（3）100000×g 沉淀的分离: 以100000×g的相对离心力离心上清液Ⅲ 30 min，收集沉淀蛋白质和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多数蛋白是胞浆蛋白，收集样品，冻干备用；(4) 上述所有收集的蛋白组分分别充分溶解于裂解液中，并选用100000×g的相对离心力离心蛋白样品 10 min，分别收集上清液，称为POL蛋白组分Ⅰ（1000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白组分Ⅱ（12000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白组分Ⅲ (100000×g 沉淀蛋白)和POL蛋白组分Ⅳ（胞浆蛋白），并用于双向电泳分离。
2.3 双向凝胶电泳分离条件
2.3.1 等电聚焦电泳
在上样之前，参考文献[10]先进行预电泳。预电泳结束后，换上样品液，在用Bradford法测定样品液的总蛋白浓度后，以150 μg 总蛋白上样，然后进行等电聚焦电泳。
2.3.2 凝胶电泳
按照SDS均一胶的配方配置11%胶浓度的凝胶。将平衡后的胶条转移到SDS凝胶上，并在胶条上覆盖一层含有溴酚兰的0.5%琼脂糖，在140 V的恒定电压下进行电泳。待溴酚兰前沿到达凝胶底端时，停止电泳。
2.4 银染、图像分析及蛋白鉴定
参照文献[10]的银染方法进行蛋白质染色。染色后，利用扫描仪对SDS凝胶板进行透射扫描。选用Melanie 4 Trial软件进行凝胶电泳图谱中的蛋白质总数和差异斑点分析与统计。用REFLEX 型MALDITOF质谱仪获得各蛋白的肽质量指纹图，采用反射模式、正离子谱测定。激光波长为337 nm，质谱信号单次扫描累加200次，用 BRUKER 肽混合物作外标。选用常规PMF和数据库比对技术直接鉴定差异蛋白质[11] 。数据库选择MSDB，检索基本条件参照文献[10]。
3 结果与讨论
3.1 直接裂解法POL全蛋白分离
图1是牙鲆受金属镉胁迫后，采取直接裂解法提取POL全蛋白质的2DPAGE图谱。从图1可看出，实验组和对照组的蛋白质斑点分布趋势基本一致，具有较好的重现性。
采用Melanie 4 Trial软件进行蛋白质斑点数目统计与分析，对照组和实验组2DPAGE图谱中的蛋白质斑点数目约为800个，其中多数蛋白质斑点的pI 范围集中在 4.5～9.0之间，蛋白质亚基的分子量在25～100 kD之间，具有较高的分辨率，适合于后续蛋白质鉴定。
通过比对分析，可获得11个差异蛋白质斑点，其中高表达蛋白2个（A6和A11）；上调蛋白6个（A1、A4、A7、A8、A9和A10）；下调蛋白3个（A2、A3和A5）。这些差异蛋白斑点均与受镉盐诱导有关，推测是牙鲆肝脏产生的应激蛋白质。
3.2 优化建立差速离心法分离POL全蛋白质技术
肝脏是动物代谢的重要场所之一，具有各类复杂代谢途径和含有丰富的蛋白质。借鉴文献［12］，选用2DPAGE分离法可获得约近千个鼠肝脏全蛋白斑点数的实验结果。
本实验选用直接裂解法提取POL全蛋白，但只获取约800个蛋白斑点的2DPAGE图谱。显然，图1中的全蛋白质斑点数偏少，不太适合进一步深入开展POL蛋白质组学研究，尤其不适合研究镉盐毒理学和筛选连续监测流动水体镉污染程度的蛋白指示物。在系列比对实验基础上，建立了差速离心法高效提取牙鲆肝脏全蛋白技术，具体实验步骤见图2。图2显示了选用差速离心法使牙鲆肝脏中不同沉降系数的蛋白质得到粗分离，减少高丰度蛋白的干扰和提高低丰度蛋白富集的效果，有助于开展牙鲆肝脏全蛋白组学研究和筛选差异蛋白质。
目前，常用于动物肝脏全蛋白质提取技术且适合于开展蛋白质组学研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、缓冲液法、裂解法及“鸟枪”蛋白质组分析法[13，14]等。但这些方法获取肝脏全蛋白种类大都低于1500种，明显少于本实验建立的差速离心提取技术。
3.3 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅰ的差异蛋白
图3是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅰ全蛋白和差异蛋白图谱。采用Melanie 4 Trial软件对图解中的蛋白质斑点数目进行统计与分析，可在亚细胞组分Ⅰ中获得约380个蛋白质斑点。比较图3A（实验组）和图3B（对照组），可获得11个差异蛋白斑点。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8为上调蛋白，而A5、A9、A10和A11为下调蛋白。
3.4 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ的差异蛋白
图4是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白和差异蛋白的2DPAGE图谱。经统计与分析后，发现亚细胞组分Ⅱ中获得约550个蛋白斑点。
比较图4A（实验组）和图4B（对照组）蛋白斑点分布和差异特性，可获得13个差异蛋白斑点，其中的A1和A4斑点为上调蛋白；A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑点为下调蛋白；A5、A10和A13为高表达蛋白（high expression proteins）。
3.5 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的差异蛋白
图5是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的全蛋白和差异蛋白质的2DPAGE图谱。经分析与统计，可获悉图5显示出约500个蛋白斑点。比对图5A和图5B结果，可进一步获悉两图之间约有14个差异蛋白斑点。其中的A10、A11和A14斑点为上调蛋白；A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑点为下调蛋白。
3.6 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白
通常认为，细胞破碎液经100000×g的相对离心力离心后所获得的蛋白上清液视为细胞的胞浆蛋白。根据 3.2 节所描述的实验步骤和离心率可获悉，牙鲆肝脏组分Ⅳ属于胞浆蛋白质。在镉盐胁迫下，所获得牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白质，视为金属镉胁迫牙鲆肝脏表达的差异胞浆蛋白。从图6中可看出牙鲆肝脏组分Ⅳ含有约850个蛋白斑点，其胞浆蛋白质种类明显高于其它牙鲆肝脏组分的蛋白质种类，说明了牙鲆肝脏含有丰富的胞浆蛋白质。比较图6A和图6B中的差异蛋白斑点分布情况和规律可获悉， 在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏表达了16种差异蛋白，其差异蛋白总数目多于其它POL组分。其中高表达的蛋白质为A1、A2、A4和A9；上调蛋白为A5、A6、A7、A10、A11和A14；下调蛋白为A3、A8、A12、A13、A15和A16。
进一步选用肽质量指纹（PMF）图谱和数据库比对技术对上述54个差异蛋白进行鉴定.结果发现，有3种同类差异蛋白，即共有51个不同的差异蛋白。在鉴定结果中发现了一些文献[15，16]中已报道的与镉盐胁迫有关的蛋白（见表1）。表1 牙鲆肝脏中表达的与镉盐胁迫有关的差异蛋白的质谱鉴定（略）
总结图3～6中所显示的蛋白斑点数目可获悉，选用差速离心法分离牙鲆肝脏的全蛋白种类约2280个，明显高于直接裂解法（800个蛋白斑点）的结果。虽然选用不同离心力分离POL亚细胞蛋白组分之间含有同一类蛋白，但只发现存在少量同类蛋白质，说明了选用差速离心法所获取的POL全蛋白中只含有少量的同类蛋白质，推测所获得的蛋白种类应高于2000种，适合于开展POL蛋白质组学研究。在镉盐胁迫下，同样也获取54种差异蛋白，其中只有3种同类差异蛋白，即镉盐胁迫牙鲆肝脏表达了51种差异蛋白，这也适合于筛选潜在的可用于研究金属镉毒理学和监测流动水体重金属污染的蛋白质指示物。显然，差速离心结合双向电泳技术显著提高了牙鲆肝全蛋白的分离效率和差异蛋白的检出率。
由于动物组织、细胞及卵等中蛋白质种类间存在丰度差异[17]，现有的全蛋白提取与分离技术不易通过单一的2DPAGE方法同时显示高低丰度不同的蛋白质。而本实验所建立的差速离心技术结合蛋白质组学技术，不仅降低蛋白之间产生沉淀现象，而且还使许多低丰度蛋白得以富集和鉴定，从中获取更多的蛋白种类。在蛋白的分离效率上明显高于现有的全蛋白提取与分离技术，如直接裂解法，适合开展蛋白质组学研究和筛选与鉴定差异蛋白质组学。前人研究已发现，热激蛋白质70S（HSP70）和过氧化氢酶均可作为监测金属镉污染或氧化损伤的指示蛋白[15，16]。从表1所鉴定的差异蛋白质种类中也含有这两种蛋白。此外， V型ATP酶和细胞骨架相关蛋白（例如：Bete 微管蛋白和actin）等均与镉代谢和受镉抑制表达有关。这说明，选用蛋白质组学及相关分析技术可筛选并鉴定许多潜在的适合作为蛋白质指示物且可用于开展镉毒理学机理、污染程度的关键指示蛋白质[18～20]。
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