发布时间：2022-07-27 11:09:12
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的基因工程疫苗样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
很多人在写论文的时候不知道为什么要写参考文献，认为论文的内容才是最重要的，对参考文献也不是特别重视，参考文献的写作对论文来说是有很大的影响的，可以通过它来看出论文的学术研究价值。下面是千里马小编收集的基因工程论文参考文献，希望可以给大家带来帮助。
基因工程论文参考文献：
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摘 要：正在研制的口蹄疫新型疫苗有10多种，分别是纳米微球黏膜免疫疫苗，表位肽疫苗、口蹄疫O型复合表位蛋白疫苗、A型重组毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗、猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗、口蹄疫O型标记疫苗、猪O型Mya98毒株空衣壳疫苗、猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）、牛口蹄疫（O型、Asia1型）二价合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活载体疫苗。其中取得突破性进展的有5种，牛口蹄疫（O型、Asia1型）二价合成肽疫苗PD50值大于6.0，免疫持续期为6个月，保存期为12个月，已完成所有实验室研究和临床试验，申请了新兽药注册并已通过初审；猪口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）PD50值大于6.0，免疫持续期为6个月，保存期为12个月，已完成所有实验室研究和临床试验，现已申请新兽药注册并通过复核试验和复审；含A型重组毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗PD50值大于6.0，免疫持续期为6个月，保存期为12个月，获得了农业部新兽药注册证书，实现了产业化；猪口蹄疫O型广谱基因工程病毒灭活疫苗已申报农业部临床试验批文；口蹄疫O型标记疫苗已完成疫苗质量研究，并已申请新兽药注册。其他疫苗研究也均取得了程度不等的进展。利用反向遗传操作技术平台，获得基因工程修饰病毒疫苗株5株：（1）rV-STN-5；（2）9O/rV-1；（3）Re-A/WH/2009；（4）Re-Mya/98/BY/2010；（5）Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重组等技术，获得其他基因工程修饰病毒9株，分别为：（1）表达O型FMDV不同亚型主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株；（2）共表达O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重组伪狂犬病毒1株；（3）表达FMDV免疫原性基因的杆状病毒2株；（4）表达猪源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重组杆状病毒3株；（5）表达口蹄疫和小反刍兽疫病毒主要保护性抗原基因的重组羊痘病毒2株。成功研制CpG-IFN、CpG-IL4以及多磷腈和CpG DNA等生物复合佐剂3种，纳米乳油佐剂、纳米粒IL-2佐剂以及多孔硅和上转换荧光纳米材料的载药系统等纳米复合佐剂材料4种，以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多种哺乳动物细胞表达质粒和多糖类免疫增强剂4种。
关键词：口蹄疫 病毒 新型疫苗 基因工程修饰病毒疫苗株 免疫佐剂
Abstract：More than 10 kinds of the new type vaccines is developing. There are 5 kinds of the new vaccine made in major progress. The first one is bivalent synthetic peptide vaccine of FMD type O and type Asia1， the second one is synthetic peptide vaccine in pig of FMD type O（peptide 2600+2700+2800）， the third one is type A recombinant strains （Re-A/WH/2009） of type O、type A and type Asia1 trivalent inactivated vaccine， the fourth one is the marker vaccine of FMD type O， and the last one is broad-spectrum inactivated virus gene engineering vaccine in pig of FMD type O. The first four vaccines were all safe to the animals， PD50 values were greater than 6.0， the vaccine immune duration is 6 months， the shelf life of synthetic peptide vaccine is 12 months， and all has applied for a new veterinary drug registration. The first one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the preliminary examination for new veterinary drug application. The second one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the inspection test and review. The third one has got the new veterinary drugs registration certificate， and realized industrialization. The last one has applied clinical trial. Varying degrees of progress has been made in other vaccine research. With the reverse genetics technology platform， five genetically engineered vaccine candidate of FMDV were screened and constructed， which were rV-STN-5， O/rV-1， Re-A/WH/2009， Re-Mya/98/BY/2010 and Re-Asia1/HN/2006. Using gene cloning and recombination technology， other nine genetically engineered vaccine candidate of FMDV were constructed， respectively is：（1） PRV TK-/gE-/PanP12A-P1；（2） PRV TK-/gG-/OAY；（3） Two recombinant baculovirus which expressing the immunogenicity gene of FMDV；（4） Three recombinant baculoviruses which expressing interferons alpha/IFNCgamma of porcine and P1 gene of FMDV type A；（5） Two restructuring goatpox viruses which expressing the major protective antigen gene of FMDV and small ruminants virus. Three biological compound adjuvants containing CpG-IFN， CpG-IL4， multi-phosphonitrile and CpG DNA， four nano composite adjuvants including Nano EC adjuvant， nanoparticle adjuvant IL-2， and drug-loaded system of porous silicon and upconversion fluorescence nanomaterials， four mammalian cell expression plasmids which can expressing IL-2， IL-4 and IFN-γ as well as polysaccharides immunopotentiator have successfully developed.
Key Words：Foot and mouth disease virus；New type vaccine；Genetically engineered vaccine candidate；Immunologic adjuvant
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关键词：螃蟹；病害防控；生物防治
1水产病害生物防治技术
这些年，国内水产养殖规模扩大。但是，一些病毒病、细菌病的感染，严重制约水产集约化发展。而抗生素药物的滥用，导致这些致病菌源的耐药性增强，以往的适用药剂久治难愈。就此，迫切需要一种生态环保型的防病措施加以替代。为此，生物技术应用而生，虽然还处于研发阶段，但是很多技术上的优势，让我们看到了降药残、抗耐药性的曙光。用于水产病害防治的生物技术，主要是借助生物基因重组、反义核酸、反义核酶等技术而改变水产动物的抗病性，以起到降低病害、提高产量、获得高效益产出的目的。从生物防治的应用效果来看，展现出这些技术优势：减少化学药剂使用量，降低药物残留，节约生产成本。降低耐药性，有效抑制致病菌源的扩散蔓延。有利于生态环保，为消费者提供绿色、无公害水产品。有利于保护生态环境，响应构建生态环保社会的响应。
2螃蟹病害影响因素
不同其他水产养殖，螃蟹养殖要获得高产高效，需要注意的事项更多。这些细节一旦疏忽，将会造成严重的病害威胁。
2.1水质问题
螃蟹生活在水中，对水质的要求更高。尤其池塘中养蟹，水体必须做出处理，否则会为病害感染创造条件。其一，定期组织消毒。消毒常用漂白粉、生石灰，在杀灭致病菌的同时，能确保水体洁净卫生。其二，投放腐殖质肥料。池塘中加适量腐殖质，主要用作肥料。达到水体变青绿色，证实养分充足。
2.2生存环境
生存环境除水质，还有居住和活动场所。螃蟹营养储备源自水中，多数以水草为食源，泥沙仅仅能辅助消化。螃蟹一般居住在较为潮湿的环境内，对于生长环境的水质有较高的要求，养殖螃蟹时应对养殖环境的水质做好清洁工作，布置适量较为茂盛的水草，使螃蟹能够小范围的活动，并围绕着产生很多昆虫、小鱼、小虾等等，会使螃蟹的生存环境更加健康，生态系统更加完善，对避免各种病害效果不错。
3生物技术在螃蟹养殖病害防治上的应用
3.1基因重组用于增强抗病性
以往螃蟹病害的防治，对消毒剂、抗菌素的依赖较大。此类药物的频繁使用，一方面影响水产养殖环境；另一方面造成病原微生物的耐药性。为避免此类问题的问题，可尝试借助病毒蛋白基因重组技术，加载到合适的载体中，而后注射到螃蟹常食用食物中，以增强其抗病体质，确保螃蟹养殖的稳定性和安全性。
3.2生物反义技术用于病毒病的控制
螃蟹养殖生产中，病毒病的危害较大，借助水平传播和垂直传播，能殃及整个螃蟹池。在病毒病的控制中，生物反义技术的作用显著。该项技术的作用原理，利用反义核酸技术和反义核酶技术，对病毒原核细胞和真细胞进行基因操作，以抑制病毒的合成和复制，有效控制螃蟹病毒病的传播。作为一种新型的生物控病技术，其用于螃蟹病毒病的防控功效是不容置否的。但是，还需要不断的完善，以扩大病毒病防控的应用范围。
3.3转基因用于增强免疫力
螃蟹养殖生产期间，在例行消毒、投药预防等工作时，或多或少在水体中会形成药物残留，久之会造成机体的某些病理病变。出于病防重于治的考虑，可借助转基因技术，提前在螃蟹体内注射特定启动因子的外源基因，使着病毒反义RNA序列提前得以表达，这样后期病毒内侵后的复制将受阻，而起到控制病害的目的。自长远角度考虑，该项技术对螃蟹养殖的病害防控是很有效的，但是当前还没有得到大面积的推广应用。
3.4基因工程苗用于预防接种
基因工程运用在螃蟹养殖中防治病害能够起到良好的作用，因为它能够帮助螃蟹排除一定的客观因素的影响，能够让水产养殖产品中的螃蟹在生存环境中可以更好的成长。基因工程疫苗的出现，让螃蟹养殖产业看到了更多的希望。基因工程疫苗从细菌和病原体中提取了具有一定免疫力的基因，然后进行了基因重组，让疫苗提高了免疫力，在与传统疫苗的对比中，提高了抗药性和稳定性，能够提高养殖螃蟹的免疫力，在提高了螃蟹免疫力的基础上，能够保证健康与天然。基因工程疫苗能够满足大部分水产养殖户的需要，能够发挥出其作用，并且在技术层面上趋于成熟，能够批量生产，满足市场的需要。
关键词：植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望
叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。
1叶绿体基因工程概述
1.1叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。
1.2叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。
1.3叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。
1.4叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。
2叶绿体基因工程的应用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。
2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。
3叶绿体基因工程存在的问题
3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
4展望
虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。
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【关键词】 K88；LTB；表达
肠毒素大肠杆菌是引起世界上发展中国家婴幼儿及到这些国家旅游者腹泻的主要致病菌，危害严重。现已知大肠杆菌定居因子和肠毒素与疾病密切相关，定居因子是大肠杆菌细胞表面菌毛，肠毒素是大肠杆菌产生的毒性分泌蛋白，有不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种。当病原菌感染宿主后，大肠杆菌首先通过定居因子粘附到小肠粘膜上皮细胞刷状缘受体上，抵抗住肠道蠕动与肠内分泌物清洗，维持ETEC在肠道内生长繁殖。然后释放出肠毒素，与小肠细胞膜上的特异受体结合，引发细胞内水、电解质失衡，造成细胞吸收障碍，产生水样、脱水性腹泻。定居因子与小肠粘膜粘附和肠毒素致毒是大肠杆菌腹泻不可或缺的两个必要条件。
我们在前人研究工作基础上，构建了一种能表达大肠杆菌pQE30-K88-LTB融合蛋白的基因工程菌株，并计划把它转化到乳酸菌中进行表达，研制大肠杆菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作为载体，经口服途径进入胃肠道，将大肠杆菌基因表达在活乳酸菌的表面，刺激机体的胃肠道产生粘膜免疫和体液免疫，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，为更有效地预防婴幼儿和旅行者腹泻，提供一种新型基因工程菌苗的候选菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒模板菌株和感受态细胞BL21、表达载体pQE-30，由本实验室保存；克隆载体pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 主要试剂、酶类限制性内切酶和其它工具酶为MBI公司产品； 弗氏完全(或不完全) 佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为Sigma公司产品；其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 引物设计 根据已发表的K88和LTB基因设计两对引物，序列如下：
K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG
K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC
LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT
LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC
1.1.4 测序DNA序列由上海生工生物技术服务有限公司测定。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增
1.2.1.1 DNA模板的制备 用移液器无菌取少量大肠杆菌接种到5ml液体LB培养基中，过夜培养后，采用煮沸法制备模板DNA。
1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR扩增 PCR反应体系为1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR缓冲液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至总量为25μL；反应的循环参数为94℃预变性10min；94℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃继续延伸10min。
1.2.2 pQE30-K88-LTB表达载体的构建质粒的提取和纯化、酶切反应、DN段的分离纯化、连接、质粒转化、菌株诱导表达等，参见分子克隆实验指南的方法。
1.2.3 蛋白电泳分析参见分子克隆实验指南。
1.2.4 重组pQE30-K88菌毛蛋白的纯化 纯化过程按照Qiagen蛋白质纯化试剂盒说明书进行。
1.2.5 重组蛋白抗血清的制备将含有纯化重组蛋白的缓冲液与弗氏完全(或不完全) 佐剂按照11充分混匀乳化好后, 按照100μg/kg抗原的剂量免疫新西兰大白兔。首次免疫2周后, 隔周加强免疫。末次免疫后一周, 颈动脉放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黄色上清液即为K88-LTB融合蛋白的抗血清。
1.2.6 蛋白质印迹分析 分别以K88、LTB单因子血清和自制的重组K88-LTB融合蛋白抗血清作第一抗体, 按1300 稀释；羊抗鼠抗体作第二抗体,按15 000 稀释使用。
2 结果
2.1 K88ac基因的扩增结果
图1: K88、LTB基因PCR扩增结果
1.3 DNA Marker DL2000; 2. K88基因的PCR产物;
4. LTB基因的PCR产物
2.3 重组K88-LTB 融合蛋白基因的表达 将鉴定正确重组质粒pQE30-K88-LTB导入到宿主菌中，诱导处理后, 进行SDS-PAGE分析。结果表明(图2)，重组K88菌毛蛋白亚基基因获得高效表达。
图2 SDS-PAGE电泳结果
1. 加IPTG诱导3h的重组菌;
2. 加IPTG诱导6h的重组菌;
3. 空载体; 4. 蛋白 Marker
2.4重组K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫学检测自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB单因子血清做一抗分别对重组工程菌株的总蛋白进行蛋白印记检测。结果表明(图3),均能检测到大小约
为31kDa的阳性反应条带。
图3 融合蛋白的蛋白印记结果
1,6.蛋白Marker; 2. 阴性血清对照; 3. K88单因子血清为一抗的蛋白印记结果;
4. 重组菌抗血清为一抗的蛋白印记结果; 5.LTB单因子血清为一抗的蛋白印记结果
关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫；疫苗；基因重组苗
中图分类号： S859.797 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-08-82-2
鸡球虫病是由属于顶复门、孢子虫纲、真球虫目、艾美耳科、艾美耳属的原虫寄生于鸡肠道引起的疾病，由于其造成雏鸡大量死亡，耐过的鸡只因为消化功能障碍，饲料转化率下降，生长发育缓慢而出现生产性能下降问题，给养鸡业造成巨大损失。感染鸡的球虫主要有柔嫩艾美耳球虫（E.tenella），堆型艾美耳球虫（E.acervulina），早熟艾美耳球虫（E.praecox），巨型艾美耳球虫（E.maxima），布氏艾美耳球虫（E.brunetti），毒害艾美耳球虫（E.necatrix）以及和缓艾美耳球虫（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球虫虫株是该属球虫中毒力最强、危害性最大的虫种，并且与其他球虫株之间几乎无交叉反应，给养鸡业带来极大的危害，据Allen报道全世界每年因此病造成经济损失超过80亿[2]。
1 重组表达亚单位疫苗
基因重组表达亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码E.tenella保护性抗原基因导入受体细菌或者细胞，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链，然后提取保护性抗原肽链，加入佐剂即成。基因重组表达亚单位疫苗的候选基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。
H. D. Danforth[3]等于1989年开启了对鸡球虫基因重组表达亚单位疫苗的篇章，他们把柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原5401导入到大肠杆菌中与β-galactosidase 融合表达，添加弗氏完全佐剂配制疫苗，经该重组疫苗皮下免疫一次的鸡在攻毒后的损害评分明显低于对照组，增重效率则明显高于对照组。Du Aifang [4]等，使用编码艾美耳球虫5401抗原转入到致弱沙门氏菌中制备的重组疫苗，试验表明最多有55%的保护力。
SO7是位于子孢子折光体上的一种抗原。M. S. Crane[5]等的研究发现重组表达的E. tenella SO7抗原免疫鸡只，不但能保护受到同源株攻毒的鸡，同样也能保护受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的鸡。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原与两种不同的真核表达载体构成的重组疫苗，做免疫保护性试验，均能够减少排卵量，具有部分保护力，而且对其他球虫也有一定的交叉保护，说明SO7抗原可以作为候选疫苗。
麦博等[7]将E.tenella表面抗原SAG10做原核表达后将重组蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雏鸡，攻虫后观察免疫效果，免疫组抗球虫指数为152.13。说明重组表达的EtSAGl0可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表达，将可溶性蛋白免疫雏鸡，攻毒后检测其重组蛋白的免疫保护效果，结果表明，这些重组表达蛋白均有一定的抗球虫保护力。
Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的单抗Mabl209从cDNA文库中筛选出GX3262基因，表达的融合蛋白分子量为115kDa，试验表明用该重组抗原免疫幼龄肉鸡对感染艾美耳球虫卵囊产生明显的部分保护作用。
B. M. Subramanian[12]等的研究发现一个来自于E. tenella 微线体的能激发宿主鸡的体液和细胞免疫反应的抗原EtMIC1，重组表达的EtMIC1能提供受试鸡部分的免疫保护。
Ralf.Hosse[13]等首次克隆表达出柔嫩艾美耳球虫的89kDa亲环蛋白 EtCTP89，在E.tenella整个生活史中表达，其从CsA到Cyps具有紧密联系，研究表明亲环蛋白A具有抗球虫作用。Nishinaka S[14]等从母系的无胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4与鸡的B细胞系MuH1 和MuH4融合制备单克隆抗体，研究表明能产生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，该抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子阶段表达，结果表明具有一定的保护作用。
2 重组DNA疫苗
重组DNA疫苗是将一种或者几种抗原基因重组到表达载体，直接或经包装注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答。
X. Ding [15]等用E. tenella微线体抗原基因EtMIC-2构建的DNA疫苗载体进行卵内鸡胚免疫，结果表明其能提高雏鸡攻毒后10天和17天的抗体水平，同时排卵量下降，增重提高。
3-lE是E.tenella子抱子与裂殖生殖阶段的表面抗原，氨基酸序列全长1086bp，含有一个由170个氨基酸组成的开放阅读框架。Song [16]克隆3-lE基因构建 pMPI3-3-lE重组质粒 ，插入到pBK-CMV载体中 ，以不同的免疫剂量和免疫方式免疫1日龄雏鸡 ，14日龄时功毒， 10d后，检测机体的抗体，结果表明不管何种接种方式 ，均能检测到最高的循环抗体水平。说明3-lE基因能够促进机体免疫系统产生免疫保护作用。D. Ma [17]用共表达3-1E和IL-15的DNA疫苗载体免疫试验鸡的结果表明其免疫保护效果（用ACI评价）比仅表达3-1E抗原的DNA疫苗的保护效果更好。Geriletu [18]用共表达E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗载体免疫试验鸡，7天后鸡脾细胞的IL-2和IFN-γ表达量上升，攻毒后免疫组的抗球虫指数也明显高于对照组，而且共表达IL-17的DNA疫苗比仅表达MZ5-7抗原的DNA疫苗的保护效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和鸡IFN基因融合克隆到真核表达载体 proVAX中构建双价融合表达质粒 proIE。将proIE于14、21日龄免疫AA肉鸡，28日龄观察免疫保护效果。结果显示， proIE双价融合DNA疫苗具有增强免疫保护作用，可显著降低粪便中的卵囊排出量（P
TA4 是柔嫩艾美耳球虫通过二硫键连接5kDa和17kDa两条多肤形成的子孢子的一种表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究发现表达E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4经肌肉免疫能提供试验鸡部分免疫保护效果，抗球虫指数（ACI）达到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球虫TA4和IL-2基因的联合表达疫苗诱导鸡体对球虫病的免疫力，结果表明TA4基因是有效的疫苗表达抗原，该抗原和细胞因子联合表达能增强DNA疫苗的免疫力，是一个不错的方法。
λMZ5-7是在第二代裂殖子阶段表达的一种分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]将λMZ5-7连接到pVAX载体构建重组质粒pVAX-Mzp5-7，用该重组质粒肌肉注射机体内表达，免疫试验表明该质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。
L Yang [23]克隆广东株Eimeria tenella的子孢子折光体抗原Etp28基因与AcMNPV-OCC（-））构建重组表达体GST-6xHis-Etp28免疫鸡只，实验表明具有部分保护作用，可以作为候选疫苗。Yang Guilian [24]，用重组鸡痘病毒表达艾美耳球虫菱形基因能够诱导免疫反应，证明有部分保护作用。D.G..J. Breed[25]， 筛选出4段不同的基因片段用于免疫鸡只，都能诱导出强烈的T细胞反应，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，试验表明能够极大的减少盲肠病变。Alireza Talebi[26]，用编码抗原的基因合成多肽疫苗用于预防鸡只，分别用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，结果是能产生很高水平的抗体，细胞内反应具有部分交叉免疫保护作用。
3 展望
从80年代开始研究鸡球虫基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球虫重组疫苗研究表明以这些抗原基因制备的亚单位疫苗和DNA疫苗对鸡球虫攻毒具有一定的免疫保护作用，但所有这些研究中的重组疫苗都还达不理想的保护效果，离临床应用还有较大距离。艾美尔球虫的基因工程重组疫苗研究之所以至今未有突破性进展，我们分析主要有三方面的原因：其一，目前对艾美尔球虫重组疫苗的研究大都是基于偶然发现的一些单个抗原基因进行的一些试验性免疫效果研究，缺乏对艾美耳球虫所有抗原的系统化研究基础。其二，由于球虫的生活史比较复杂，球虫发育的每一阶段都具有免疫原性，对球虫感染诱发保护性免疫起关键作用的可能不只一种抗原，可能需要多种抗原的共同作用才能诱发保护性免疫反应。其三，对球虫感染宿主的机制现在仍然不清楚，这也是制约柔嫩艾美耳球虫疫苗研究的一大难题。随着分子生物技术的不断发展和对球虫基因的研究不断深入，最终能研究出高效的基因重组疫苗。
参考文献
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1限制酶的作用及影响因素
1.1 作用：切割特定的核苷酸序列
[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DN段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DN段种类数是（ ）
A.3 B.4 C.9 D. 12
【答案】C
【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DN段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DN段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DN段。因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。
1.2 作用结果：形成DN段末端
黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。
平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以下图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。
（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DN断。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DN断。
【答案】（1）耐高温 （2）引物对B （3）否 （4）农杆菌 （5）①2 ②1
【解析】：由图1―①过程知，用EcoRI酶和AluI酶切割抗原基因DN段会得到XY片段，由图1―②过程可知，用EcoRI酶和SmaI酶切割质粒产生MN片段。这样形成的两个DN段用DNA连接酶形成重组质粒。其中X、M连接处是EcoRI酶切割位点，M、N之间还有一个PstI酶切割位点。如果用EcoRI酶和PstI酶切割重组质粒，将会在两个切割位点切割产生2种DN段。但若用EcoRI酶切割重组质粒，由于只有一个切割位点，所以只产生一个DN段。
[高考赏析]（2005、天津理综II 31）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―GGATCC―，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？
【答案】：
①
②
③、可以连接。因为由两种限制性内切酶切割后形成的黏性末端是相同的。
【解析】：基因工程中往往用相同的限制性内切酶切割目的基因和运载体，但不同的限制性内切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互补配对的。因此，基因工程中有时也采用不同的限制性内切酶切割目的基因和运载体。
1.3 作用实质：使特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
1.4 影响因素：限制酶是一类酶，因此其活性受温度、pH等因素的影响。
[高考赏析]（2007、全国II）下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（ ）
A、一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B、限制性内切酶的活性受温度影响
C、限制性内切酶能识别和切割RNA
D、限制性内切酶可以从原核生物中提取
【答案】：C。
【解析】：由以上分析可知限制性内切酶能识别和切割DNA。
2 限制性内切酶的特异性
限制性内切酶的特异性是指一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的切点上切割。一种酶识别切割部位一般具有反向重复序列，即在切割部位一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
3 限制性内切酶与其它酶的比较
酶的种类 作用
限制性内切酶（限制酶） 将DNA分子的脱氧核苷酸链的磷酸二酯键切开
DNA聚合酶 按模板有要求将单个脱氧核苷酸连接形成DNA的子链，在DNA复制时起作用
DNA连接酶 两个DN段之间形成磷酸二酯键，缝合断口
关键词：生物技术；制药；应用
生物技术也可以称作是生物工程。以现在化的生命科学为主要基础，综合各种科学技术，科学原理以及先进的科学手段，按照设计对生物体和生物原料的加工为人类生产出具有重要作用的生物技术产品。生物技术是人们对动植物以及微生物本身的物质加工而成，为人们生产数优质的生物技术产品更好的为社会服务。现代生物制药技术其中包括现代化生物技术和发酵技术，生物技术来源于相关的学科和生物学发展相融合的产物，其中以重组DNA技术为核心主要的基因工程，这之中还包括有生化工程、细胞工程、微生物工程和生物制药等各个领域。生物技术是综合许多种现代科学理论与生命科学研究出来的一种高新技术，运用先进的技术手段为我国制药行业的研究创造出广阔的应用前景。
1 发酵工程制药
现代的发酵制药工程。又可以被称作微生物工程，是指采用现代的生物技术手段，利用微生物的特定功能，为人类生产出有用的产品，工业生产的过程直接运用微生物技术。微生物代谢生产的生物技术就是发酵工程制药。发酵工程制药中含有，抗生素、激素、维生素等相关的生理活性物质。主要的研究对微生物改良和筛选，工艺研究，等处理产品后续的问题。如今DNA重组技术对微生物菌类的改良有着重要的作用。在20世纪70年代中，基因技术和细胞技术融合等生物技术的不断发展，发酵工业进入了现代化的工程阶段，其中生产的产品有酒精类饮料，还有胰岛素、生长激素和抗生素等多种保健药物。发酵工程制药利用微生物生长以及代谢制作中药，此类制作中药方式比一般方式都优越，可以全面的改善药性，降低副作用，橹幸钚猿煞痔峁┬碌姆⒄狗较颍产生新的药物作用，针对各种适应症的治疗，充分保护中药成分，避免中药活性成分遭到破坏，从而做到节约药物资源。
2 基因工程制药
基因工程制药是指分子水平上基因的操作，根据人类的需求所设计的，按照设计方案创建含有新性状的生物新品系，并且能使生物新品系稳定的遗传给下一代。基因工程与工程设计运用了相似的方法，具有明显的理学与工程学的特点。工程制药通过DNA技术将疾病的蛋白质、酶、核酸等基因药物转移到宿主细胞进行表达和繁殖，最终可以获得相应的治疗药物。抗生素通常是人体的活性因子，主要研究基因的鉴定、克隆导体的构建，导入产物分离纯化等问题。基因工程被人们掌握时间并不是很长，但已经多次的取得了实际性的成果和应用价值，基因技术已经成为我国的核心技术，将在制药方面充分的发挥重要作用。
3 细胞工程制药
相关于细胞工程制药的范围还没有确切的说法，细胞工程是根据分子生物学原理，应用了细胞培育技术以及细胞水平进行遗传操作。细胞工程大体可分为细胞质工程和染色体工程。细胞工程的主要关键是运用植物和动物的细胞培养作为药物生产技术。利用细胞技术对动植物的培养可以生产出人类活性因子，以及单克隆等抗体产品。也可以生产出活性因子疫苗等DNA产品。在地理条件和气候环境的影响下植物细胞代谢产物含量仍然很高。系统正在研究培养，人参、三七等制药用的植物，并对相关的培养条件做出了。分析表明，人参细胞培养物与药理活性都和普通种植的人参没有明显差异。对于某些植物的细胞培养与生产已经达到了商业化作用。除了对细胞大规模的培养之外，毛状根与不定根的培养也很成功。黄氏毛状根的培养效果与价格与药物黄氏相似，希腊毛地黄细胞应在褐藻酸欲的固定情况下培养，可将有毒的毛地黄物质转化成地高辛，运用紫草细胞培养生产紫草宁等根据野生新疆雪莲的抗炎等作用，相关人员等进行了细胞培养物与天然新疆雪莲抗炎、镇痛的药理实验，实验表明新疆雪莲细胞培养物，可以成为野生雪莲的替代品。资源短缺也是比较严重的问题，对于资源短缺完全可以利用细胞培养技术对犀角等相关药用动物器官进行培养，此方式就能解决资源短缺的问题。
4 酶工程制药
酶工程指的是用酶、细胞，等拥有独特的催化功能，借助生物技术手段为人类制造出需要的产品。酶学理论与化工技术结合形成的新技术就是没酶工程。现如今已经有很多国家都运用了固定化的酶和细胞生产药品。没工程技术是现代生物技术的重要部分，固定化酶不仅能合成药物分子。还能用于对药物的转化。我国运用微生物的两部转化方法成功的生产出维生素C，酶工程主要研究产药酶，酶细胞固定化相关的操作条件等。酶工程的应用前景一片光明，发酵工业与化学合成工业发生了巨大的改变。药用植物的有效成分来源于植物的次生代谢产物。现如今已有很多个国家充分的应用固定化细胞与固定化酶进行药物的生产。
5 结束语
综上所述，我国的生物技术已经越来越重要，目前生物制药的研究成果数量日益增长，其技术制药研究已经不断的深入各个领域，中药研制新药的环节也在不断的介入在新药研发中生物技术制药形式相对比较重要，使生物技术制药成为了研发主流。生物技术同时还具有对珍稀传统药材的保护同时还能生产出大量的高品质药材和药品活性成分，使药品活性成分的含量有效的提高。合理的应用现代化生物技术，使我国的制药行业不断地取得更大的发展。
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