发布时间：2023-05-31 15:00:08
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的干细胞培养技术样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
述。
1胞外生物支架材料的应用
研究者对各种胞外支架材料进行了研究，包括聚乙烯树脂、海藻酸盐、聚氨酯泡沫等，都是具有亲水多孔性结构的天然或人工合成的有机大分子。在一定的培养条件下，肝细胞在基质孔隙中重组形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞-细胞接触，且形成类似于体内组织的结构，因而表现出比早先单层贴壁培养的肝细胞更好的生理功能。
1.1海藻酸盐(alginate)海藻酸盐是目前常用的促进肝细胞聚集的物质，藻酸盐海绵体具有高度多孔的结构，孔径在100～150 μm，由于藻酸盐是亲水性物质，所以肝细胞能容易地进入基质内部。Glicklis［1］等以藻酸盐海绵体为支持基质培养肝细胞。DNA测定表明最初两周肝细胞的数量并不增加，MTT测定显示绝大多数细胞保持活力。接种24 h内在藻酸盐海绵状结构内观察到活细胞聚集体，这种聚集体在培养的第四天平均直径100 μm，与基质孔径同一数量级。聚集体的三维结构促进了细胞功能的表达：1周内达最大白蛋白分泌量。微囊化肝细胞培养利用半透膜将肝细胞包在囊内(囊壁分子量截率
1.2聚氨酯泡沫(Polyurethane foam，PUF)聚氨酯泡沫是另一种高度多孔性的过滤材料。日本Gion等［3］以PUF为材料设计出一种填充床式生物反应器，以该反应器为基础组成的混合型生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可显著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血压。Pahernik等［4］研究了以PUF材料进行猪肝细胞高密度培养的可行性，作者认为PUF是一种生物相容性较好的材料，适于肝细胞的高密度培养。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethane membrane，PΜM)作为肝细胞培养支持物，构建固定床(fixedbed)生物反应器并用于大鼠肝细胞的高密度培养。PΜM孔径从上层到下层逐渐递减，肝细胞悬液流经PΜM时，5 min内黏附的肝细胞密度可达2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高达99%；黏附肝细胞以轻度聚集的球形体形式存在，白蛋白分泌持续时间比单层培养长。
1.3微载体(microcarrier)微载体目前经常用于生物型人工肝的肝细胞培养，可以大大提高生物反应器内肝细胞的培养密度。微载体细胞培养技术可以形成以微载体为核心的肝细胞聚合球，细胞浓度可达107 cell/ml，使肝细胞不贴壁而呈悬浮状培养，更接近于正常的生理状态。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝细胞与不同浓度的明胶微载体进行旋转培养7 d后，2×105 cell/ml与1 g/L微载体组获得的细胞浓度为4.5×106 cell /ml；5×105 cell/ml与3 g/L微载体组细胞浓度为7.1×106 cell/ml。微载体上沾满细胞，呈球形状态。肝细胞24 h可产生5 ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50 ng/ml苯巴比妥诱导3 d后，则产生26 ng/ml的MEGX，显示了肝细胞代谢的潜能。目前，微载体培养是动物细胞大规模高密度培养中技术相对完善及有实用价值的一种培养模式，并且已有多种商品化的微载体可供选择。
1.4中空纤维(hollow fiber)中空纤维是人工合成的高分子材料半透膜，纤维内腔直径约200 μm。将数百或数千束纤维装在容器中，即中空纤维舱，最常用于构建生物型人工肝生物反应器。Liu等［7］对体外中空纤维肝辅助装置中的永生化猪肝细胞进行了研究，发现细胞接种后增殖迅速，在培养的25 d期间，肝细胞保持着对安定及扑热息痛的代谢活性。超微结构检查可见形成胆小管结构的桥粒及连接复合体。Sosef［8］等将猪的自体肝细胞置于中空纤维仓，培养24 h后治疗猪急性肝功能衰竭（FHF）模型，明显延长存活时间，降低血氨水平。在多种材料结合的基础上，研究者提出并尝试了多种有应用价值的肝细胞培养系统。Arnaout［9］等在中空纤维外腔植入微载体培养的肝细胞构建生物型人工肝，对FHF和慢性先天性代谢性肝病动物模型均有肝辅助作用。Nyberg［10］等在中空纤维内腔内种植胶原凝胶包埋肝细胞，培养液在胶原外纤维内循环，形成肝细胞培养的三维框架，患者血浆在纤维外灌流，体外实验证明此系统具有合成蛋白功能及药物代谢功能，动物实验能改善FHF动物模型肝功能指标，但未见进一步的临床应用报道。Dixit［11］将两种不同的中空纤维管置于同一外壳内，其中一种通过培养液，纤维外部附肝细胞; 另一纤维管循环宿主血液/血浆。体外实验研究表明这种肝细胞反应器可提供特异性的肝细胞功能。Gerlach［12］等将细胞培养于三维网状交叉的中空纤维之间，实验表明可使肝细胞高密度培养，肝细胞功能维持可达5周。Funatu K［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在离心条件下中空纤维内培养肝细胞，3 d内形成表面光滑的柱型组织化结构(Organoid)，维持肝功能达4个月以上，Nakazawa［14］应用此种生物反应器治疗FHF猪动物模型可改善其生化指标，提高生存率。
1.5其他Tobe S［15］等报道大鼠的肝细胞能够附着着在一种缺乏唾液酸蛋白的聚DP苄乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成锚定的多层聚集体，在培养液中加入EGF和胰岛素时形成稳定的三维结构。这种聚集体中的肝细胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推测可能是多层聚集体中的细胞通过聚集体的形成而稳定地分化所致。Ohshima等［16］将聚乙烯树脂(Polyvinyl formal，PVF)置于一圆柱形容器内组成一种填充床式生物反应装置，适于肝细胞的培养密度可达107 cell/cm3，且培养肝细胞具有良好的氨代谢、尿素合成及分泌白蛋白等功能；扫描电镜观察显示，肝细胞在形态及排列等方面均优于单层培养。
2模拟微重力培养
模拟微重力肝细胞培养是利用旋转式生物反应器，提供一个模拟微重力的条件，反应器内培养的细胞呈一种失重状态，可自发形成组织样结构。研究者们在一系列的细胞三维培养研究中先后取得重要进展表明，利用回转生物反应器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)模拟微重力培养环境，可以显著改善离体细胞的生长状况，使在普通培养条件下只能二维贴壁生长的动物细胞表现出三维增殖与分化。Rise k等［17］等利用模拟微重力培养环境共培养纯化的肝细胞与胆管上皮细胞，发现肝细胞与胆管上皮细胞自发聚集于聚合物支架上，生长达2个月，在三维结构上肝组织内有肝索、胆管以及管状内皮结构形成。国内张钰鹏［17］也在模拟微重力条件下进行大鼠原代肝细胞微载体培养，多个微载体表面的肝细胞可连接成团，形成“肝细胞微载体聚球体”的基本结构模式。透射电镜下，肝细胞在不同部位显现不同的膜结构：与培养液接触的表面出现许多不规整的微绒毛，类似体内的肝窦面。肝细胞之间则胞膜平直，膜间缝隙狭窄，类似体内的肝细胞间接触面。
3展望
【关键词】三维细胞培养；流感病毒；监测
【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0118―01
2009年5月，新甲型H1N1病毒造成世界范围内的大流行，2013年春季在中国长三角地区流行甲型H7N9流感病毒，加强对流感病毒监测对于疫情分析、流行趋势研判、疫苗研制等方面有着极其重要的意义。目前国内在流感病毒监测方面主要采用核酸检测和单层贴壁细胞培养技术。由于标本采集的问题及细胞在体外环境下生长逐渐丧失了原有的性状[1]，在很多情况下，所取到的研究结果和实际结果不符合。传统单层细胞培养得率过低是大量病毒监测工作中难以突破的的瓶颈。我们建立了三维细胞培养技术方法在流感病毒的网络监测中得到较好的应用。
1 材料与方法
1.1 样本采集：上海市黄浦区流感网络监测定点医院（第二人民医院）流感监测点于2013年1-2月冬春季采集的类流感病例鼻咽拭子合计76份。
1.2 核酸抽提：取鼻咽拭子病毒采样液140微升，使用QIACUBE?核酸抽提仪，试剂使用QIAamp? Viral RNA Mini Kit（250）试剂盒提取病毒RNA。
1.3 流感病毒核酸检测：Real-Time RT- PCR检测使用上海之江生物技术有限公司甲型流感病毒核酸检测试剂盒（A型/B型流感核酸检测试剂盒、H1、H3、H1N1（2009pdm）型核酸检测试剂盒），PCR扩增仪使用国产上海宏石SLAN荧光定量PCR扩增仪。反应条件如下：45 ℃ 10 min逆转录，95 ℃ 15 min变性，95 ℃ 15s，60℃ 1min FAM通道检测荧光，40个循环。
1.4三维细胞培养
1.4.1培养仪：采用Hamilton?公司的BioLevitator?三维细胞培养仪。
1.4.2细胞来源：75mL细胞培养瓶复苏的狗肾细胞（MDCK），消化后得到悬浮细胞。将悬浮细胞接种到GEM微载体上，在培养设备上运行接种程序。当细胞生长覆盖率达到80%以上时，加入两倍量的新的GEM微载体。继续培养，在培养过程中根据需要更换新的培养基。当细胞生长覆盖率达到80%以上时，将培养管内溶液分装到三个新的培养管中。向三管中分别加入两倍于原体积的新培养基和两倍于原数量的GEM微载体。在培养设备上运行接种程序。
1.4.3细胞生长：当细胞生长覆盖率达到80%以上时，取出培养管，用磁铁吸住GEM微载体，移去培养基。用3-Dissolution试剂将GEM微载体溶解，用磁铁吸去磁性颗粒，得到细胞。转移细胞溶液至新的50mL管中，将细胞清洗、悬浮后细胞分装并计数。细胞样品可以用于下游的检测或其它应用。
1.4.4接种病毒
1.4.4.1接种中毒：当细胞生长覆盖率达到要求后，开始进行病毒感染实验。采用上述9份季节性流感病毒H3核酸检测阳性标本分A、B组进行染毒试验。A组为贴壁细胞培养的细胞，B组为三维细胞培养的细胞。置37?C， 7.5% CO2浓度培养，每天观察，当有90%的细胞出现CPE后，进行收毒。
1.4.4.2收毒后的病毒液可以用移液管吸入离心管，在1，000-2，000转下离心10mins，以此除去细胞碎片，将离心后的上清夜转移，弃底部沉淀，该上清液进行病毒滴度测定。
1.4.5 三维细胞培养细胞的观察与计数
1.4.5.1取50μL培养液（cells on GEM?）至96孔板中的一个孔内。加入100μL Hoechst 33342溶液到该孔内。室温下放置15-20分钟。用显微镜在紫外和DAPI滤光片下观察。
1.4.5.2细胞计数用CubeMagnet将剩余的400μL细胞样品中的生长在GEM上的细胞吸附到底部。用移液器将培养基移除。加入1mL PBS到样品中。在CubeMagnet帮助下，移除PBS缓冲液。加入200μL 3-Dissolution到样品中。37?C孵育10-15分钟，用显微镜观察直到GEM被完全溶解。将盖玻片平铺在血细胞计数器上。加入50μL Trypan Blue和50μL细胞样品到微离心管中。盖上盖子混匀。取10μL细胞/Trypan Blue混合物到盖玻片下面。用血细胞计数器对活/死细胞进行计数。
1.5 MDCK单层细胞培养：参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.6 血凝试验方法：参照中国国家流感中心实验室流感病毒监测方案操作方法。[2]
1.7 结果的统计与分析使用统计学软件stata 7.0。
2 结果
2.1 标本直接核酸检测结果：经RT-PCR筛查甲型流感核酸阳性标本9份，阳性率为11.8%（9/76）。其中H3分型阳性6例，未分型（包含H1、H3、H1N1（2009pdm））共3例。CT值分别为29.2，31.2，32.1，33.2，35.2，37.5 。
2.2细胞生长效率比较：75mL细胞瓶狗肾细胞（MDCK）工作容量为10mL，细胞总数为2*106个。传统贴壁细胞培养传代一次可以得到9瓶25mL细胞瓶的狗肾细胞用于病毒培养，其工作容量约为18毫升单位细胞数2.5*105个/mL，得到的细胞总数约为4.5*106个。利用三维细胞培养技术计数培养后可以得到4瓶40mL细胞悬液。用细胞计数板5次，结果见表一。 计算公式：总细胞数=单格细胞计数*104*160/ml。
2.3 接种中毒后血凝效价比较：用9份甲型流感病毒病毒核酸阳性标本，采样液染毒后血凝效价测定结果见表二，A组为单层细胞贴壁培养中毒，B组为三维细胞培养后中毒实验。
以上结果用几何均数配对T检验统计分析，结果P > |t| = 0.5943，显示三维培养传代细胞的染毒实验滴度与贴壁细胞培养的细胞中毒后血凝试验效价结果无显著性差异。
2.4 甲型流感病毒细胞培养后核酸检测结果比较：将9例经直接检测甲型流感核酸阳性标本分别接种三维培养和贴壁培养的MDCK细胞，CO2培养，观察中毒后，重新抽核酸进行核酸分型检测，均为H3型季节性流感。结果见表三。A组为单层细胞贴壁培养中毒液检测，B组为三维细胞培养后中毒液检测。
以上结果用配对T检验统计分析，结果P > |t| = 0.3956，贴壁细胞培养和三维细胞培养结果无显著性差异；细胞培养后病毒大量增殖，使得核酸分型检测结果更明确。
3 讨论
流感病毒的监测包括核酸检测和细胞培养两方面。细胞培养是对流感病毒对细胞的敏感性，抗原性分析的必须方法，也可以通过细胞中毒实验使得某些直接核酸检测结果不明确的标本得以明确病毒核酸的分类，通过较少病毒载量的标本在细胞中增殖也是对一些不明分类的流感病毒深入研究的基础。
三维细胞培养技术在细胞培养上更贴近于自然状态，细胞生物活性较高。[3]利用该技术得到细胞对已病毒培养更为高效。三维细胞培养技术可以在病毒培养中得到极大的发展。对于三维结构下细胞生物活性较高状态的细胞染毒实验可能大大提高流感病毒染毒效果。得益于三维培养技术的革新，使得该技术能够培养在传统培养板上难以培养的细胞；细胞生长状态更加接近于体内状态，利于细胞的极化与功能化[4]；省去消化、离心等操作，简化细胞培养流程；可以在短时间内获得大量细胞；细胞的一致性可以得到保障；微载体透光性好，没有自发荧光，不必与细胞分离就可以进行后续观测；细胞培养表面大，可以获得高密度细胞；微载体材质与结构适合细胞生长，表面提供各种蛋白包被可满足特殊细胞培养的需求；微载体内嵌磁性颗粒，便于外加磁力进行操控；大大减少耗材用量，降低耗材成本，并且有利于环保；减少研究者在细胞培养上花费的精力。
本次研究中，三维细胞培养方法不仅比普通单层细胞培养有更多的细胞收获，而且在病毒敏感性，血凝效价实验等各方面与单层细胞培养方法无显著性差异。
三维细胞培养技术在流感病毒培养中得以较好的应用，该技术在细胞传代、细胞复苏、细胞冻存等细胞技术都已经较为成熟。特别是细胞传代的应用，细胞培养技术与新材料新方法结合的全新思路解决和突破了传统贴壁细胞培养技术细胞传代细胞得率过低的技术瓶颈，对于我们实验室高通量的流感病毒监测、培养具有十分重要的意义。
参考文献：
[1] 胡康洪， 姚颖.三维细胞培养技术的研究与应用， 医学分子生物学杂志， 2008， 5（2）：185-188
[2] 全国流感监测方案（2010版）
[3] ALVIA，STUPACK D G，Cell survival in a three-dimensional matrix[J].Methods Enzymol，2007，426：85-101.
[4] 盛治国， 郭家彬， 彭双清. 体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用， 中国药理学与毒理学杂志， 2007. 21 （5）
诱导多能干细胞只是干细胞的一种，但是，可以绕开使用胚胎干细胞的伦理限制，而且具有丰富的来源，因此被视为再生医学和器官移植的重要突破。此后，研究人员就希望能用诱导多能干细胞在实验室中培养和生成各种器官、组织和细胞，用以治疗更多疾病。现在，研究人员发现，诱导多能干细胞确实能培养并生成有生理功能的多种器官、组织和细胞。
诱导多能干细胞培育出肝脏
英国《自然》杂志2013年7月3日报道，日本横滨市立大学谷口英树研究小组与美国西奈山医学院研究人员合作，利用人类诱导多能干细胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠体内，结果这些肝芽成功生长成微型人类肝脏或称“迷你肝脏”，并像健康器官一样具有正常的肝功能。这是世界上首例用诱导多能干细胞培养的立体肝脏。在此之前，已经有研究小组能够用诱导多能干细胞培养出肝细胞，但是还不能培养出可以在人体内发挥功能的立体结构肝脏。
日本和美国研究人员利用人类诱导多能干细胞培养的肝脏从严格意义上来说还不是肝脏，但是可以看成是微小肝脏，它们的直径只有4毫米～5毫米，却表现出了肝脏的生物活性和生理功能。
研制的过程是，将人类皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞，并且让其分化成表达肝脏基因的早期肝细胞。然后在培养基中加入从脐带血中提取的内皮细胞和制造骨骼、软骨和脂肪的间充质干细胞，内皮细胞的作用是指挥血管排列和生成。此后，这些细胞在培养基中自行成长为球状的细胞团，如同人类胚胎中肝脏最初的发育一样。两个月后，这些细胞团快速生长成直径为4毫米～5毫米的微小肝脏，研究人员再把这种微小肝脏移植到小鼠的皮肤下。此后，微小肝脏与小鼠的血管慢慢连接起来，最终发育成类似成体肝脏的器官。这种微小肝脏还接管了小鼠肝脏的一些正常的工作。
为了验证这种微小肝脏是否有生理功能，研究人员对小鼠注射了两种药物，以检查肝脏是否有代谢药物的功能。这两种药物是抗炎药酮洛芬和治疗高血压的药物异哇胍。结果发现，小鼠的血液中产生了通常来自人类肝脏的代谢产物而非小鼠肝脏的代谢产物。这说明移植进小鼠体内的微小肝脏发挥了作用。
同时，研究人员还做了一个对照研究，以检测微小肝脏是否有解毒功能，以便帮助肝功能衰竭的小鼠存活。实验用了两组小鼠，一组小鼠的每一只体内都植入了12个诱导多能干细胞培养的微小肝脏，另一组小鼠作为对照组，未植入微小肝脏。研究人员对两组小鼠都注射白喉毒素。结果，移植了微小肝脏的一组小鼠有近1/3存活超过了40天，而对照组小鼠在10天内都死亡了。
此外，研究还发现，诱导多能干细胞生成的微小肝脏能够分泌肝脏的特异性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且产生人类特异性代谢物。诱导多能干细胞生成的微小肝脏最为重要的特点是，它很快就能与附近的血管融合，从而获得受体血液系统的支持。这是器官移植最重要的一步，因为有了受体血液系统的支持，而且不受到受体免疫系统的排斥，移植的器官就会持续生长，成为受体体内的一员。因此，尽管这种能首次连接到受体血液系统的具有复杂生理功能的器官还比较微小，但已经是再生医学的一个重要里程碑。
当然，未来如果能进一步表明诱导多能干细胞培养的微小肝脏移植进人体后不受人的免疫系统排斥，那么微小肝脏就可以移植给人体，至少可以取代成人30%的正常肝脏功能。这对于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意义。当然，如果诱导多能干细胞培养肝脏的技术进一步成熟和有效，则有可能培养出像成人肝脏那么大的肝脏，器官移植将会获得突破性进展，因为病人再也不用长时间等待供体器官了。但是，要达到这一步可能还要等上较长时间。
培育简单器官和组织更容易
由于肝脏具有较为复杂的多种生理功能，如解毒功能、代谢功能、分泌胆汁、免疫防御功能等，这就意味着用干细胞培育肝脏更具挑战性和复杂性。因此，在用干细胞培育较为简单的器官方面，应当更有收获。事实也完全证明了这一点。
现在，多个国家的研究人员已经能用诱导多能干细胞培育多种简单的器官，如血管、肌肉、毛囊等。
美国麻省总医院史迪尔肿瘤生物学实验室主任雷克思·杰恩等人利用人类诱导多能干细胞衍生的血管前体细胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且这些血管维持活性长达280天。
用人类诱导多能干细胞培育的血管主要可以用于治疗心血管病和糖尿病导致的血管损害。比如，糖尿病晚期常导致病人的大血管并发症，如动脉粥样硬化、冠状动脉狭窄（可导致冠心病甚至心肌梗塞）、供应大脑的血管狭窄（可导致脑缺血甚至脑梗塞）、供应下肢的血管狭窄（可导致下肢的疼痛和坏疽），这时就可以用再造血管的方法来治疗晚期糖尿病人。同时，还可以用新血管为新生组织提供血液供应。
过去的一些研究显示，利用人类诱导多能干细胞能生成构建血管所需的内皮细胞，但是，将这些细胞导入到小鼠身上却无法形成持久的血管。于是，麻省总医院的研究人员利用来自健康成人以及1型糖尿病病人的人类诱导多能干细胞，在小鼠大脑外表面和皮肤下生成了血管。研究小组采用了一种最初用于人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的方法，以此来扩大和培养人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞群生成能够形成血管的内皮细胞。
随后，研究人员把这些内皮细胞与间充质前体细胞（可生成必要的结构细胞）一起移植到小鼠大脑的表面。在两周内，移植细胞形成了血液灌注的血管网络，它们与邻近的天然血管一样发挥了功能，并在小鼠体内持续发挥功能长达9个月。此外，研究人员也用同样的方法在小鼠皮肤下移植内皮细胞与间充质前体细胞，结果也生成了功能性的血管。但是，在皮肤下的移植需要移植更多的细胞，约为移植到大脑的5倍以上，并且生成的血管的寿命比在大脑生成的血管寿命短。
这项研究还表明，来自健康人的细胞和患1型糖尿病患者的人类诱导多能干细胞衍生的内皮细胞都可以生成能长期维持功能的血管。但是，不同的人类诱导多能干细胞和包括来自同一患者的不同细胞系在生成血管的潜力上有差异，因此，还需要更深入地了解干细胞生成血管的更多机理，而且需要找到更好的方法来操控生成特定器官所需的特异内皮细胞类型。
当然，由人类诱导多能干细胞生成的血管是否能应用于糖尿病病人，还需要在安全性和实用性方面进行更深入的研究，但毕竟这项研究已经让人们看到了一些希望。
另一方面，用干细胞培养成熟的心肌也有了新的突破。过去，在培养基中培养的心肌细胞并不像人体心肌细胞那样具有生理功能，例如传导生物电信号和收缩。为了解决这些问题，美国杜克大学生物医学工程系的尼纳德·伯萨克等人采取了一种新的方法来培育心肌，即用胚胎干细胞来培养心肌。胚胎干细胞不同于诱导多能干细胞，可能会受到伦理制约，而且所能获得的胚胎干细胞也有限，当然其全能分化和生长的效果优于诱导多能干细胞。
研究人员在实验室中把人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞放入三维水凝胶中。此后，心肌细胞自行组装成心肌束，形成了纤维细胞在外、内皮细胞穿插其中的三维结构。而且，这种组织并非是心肌细胞的堆积，而是一块8毫米×8毫米的心肌组织，并且达到了与体内心肌细胞类似的功能指标。通过注入不同的药物可以检测心肌电传导性能的变化和检测药物对心肌收缩能力的影响。由此证明，这种由胚胎干细胞培养的心肌组织不仅可以传导生物电流，而且可以自主搏动。
研究人员认为，这种心肌组织的结构和功能都超过了以前的人工心肌，也是迄今为止和人体组织最接近的人造心肌薄片。虽然这是依靠胚胎干细胞培养的，但是，通过仔细总结培养的机理，未来可以通过提取心脏病人的皮肤细胞以获取诱导多能干细胞，再由后者来培养特异的心肌组织或心脏，如此，则可以修补病人的坏死心肌，或者直接为病人移植用其自身的皮肤细胞培养的心脏。
培育血细胞
诱导多能干细胞还能培育更多的血细胞，以用于输血、诊断和治疗疾病。
人的血液由血浆和血细胞组成。血浆相当于结缔组织的细胞间质，为浅黄色半透明液体，其中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物等。血细胞则分为红细胞、白细胞、血小板。人的血细胞总是在不断地新陈代谢。红细胞的平均寿命约120天，有粒白细胞和血小板的生存期限一般不超过10天。淋巴细胞的生存期长短不等，从几个小时到几年。一般而言，血细胞及血小板来自造血器官，红细胞、有粒白细胞及血小板由红骨髓产生，无粒白细胞则由淋巴结和脾脏产生。但是，由于疾病和造血功能异常会导致一些血液方面的疾病，如贫血。
贫血是指人体外周血液中红细胞容量减少并低于正常范围下限的一种疾病，但是由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白（Hb）浓度来代替。在中国一般把成年男性Hb
因此，贫血的根本原因是红细胞减少，因而导致血红蛋白减少，血液携氧供氧能力下降，这就会对全身造成不同程度的影响。例如，造成神经系统的损害，表现为头昏、耳鸣、头痛、失眠、多梦、记忆力减退、注意力不集中等；贫血更影响呼吸循环系统，表现为气急或呼吸困难，并且有心悸、心律失常和心功能不全；贫血也影响消化系统，因为贫血时消化腺分泌减少甚至腺体萎缩，进而导致消化功能降低、消化不良，出现腹部胀满、食欲减低、大便规律和性状的改变等。
长期以来，治疗慢性贫血的效果并不如意。研究人员也在寻找新的方法，例如输血和单独输入红细胞。但是，输血和输入红细胞也可能发生排异反应和输血反应，甚至染上其他传染性疾病。如果能用病人的皮肤细胞产生诱导多能干细胞，再由后者生成红细胞，就可以把红细胞输入病人体内，治疗贫血。
现在，美国波士顿大学医学院的乔治·墨菲与波士顿大学公共健康学院的戴维·希尔领导的研究团队采用一种新的方法，对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了大量的人类红细胞和血小板。这些红细胞有望用于治疗贫血和诊断疟疾、镰状细胞贫血，而血小板则可用来检查心血管病和治疗凝血障碍。
【关键词】 脂肪干细胞； 口腔上皮细胞； 组织工程； 共培养
中图分类号 R329.2 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）36-0001-03
各种原因造成的尿道狭窄、尿道缺损是一个难题，近年来，口腔黏膜被认为是用于尿道重建的较为理想的替代物。但口腔黏膜的获取，也会给患者带来诸如感觉麻木、开口及活动受限等合并症。组织工程技术的发展为这一难题的解决带来了新的希望[1]。组织工程口腔黏膜有望成为尿道重建领域一个理想的修复重建材料[2]。脂肪干细胞（adipose tissue derived stem cell，ADSC）是2001年Zuk等[3]从人脂肪组织中分离培养出的一种多能干细胞，它能够经由旁分泌方式，分泌多种生长因子，这些生长因子能够激活上皮细胞，促进上皮缺损的修复[4]。将ADSC引入组织工程口腔黏膜研究，将具备良好的应用前景。本实验研究体外共培养环境对犬口腔上皮细胞（oral keratinocytes，OK）和ADSC增殖速率、移行速率的影响。
1 材料与方法
1.1 ADSC的获取和鉴定
取Beagle犬腹部皮下脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶（Worthington，美国）消化获得ADSC，以含10% FBS的DMEM培养液（Gibico，美国）培养，每3天换液一次，细胞融合达90%时，以0.25%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化传代。取P3 ADSC，行流失细胞检测，检测细胞表面CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和CD106的表达。
1.2 OK的获取和鉴定
取Beagle犬颊黏膜，经2.0 U/ml的Dispase Ⅱ（Roche Corporation， Germany）消化、0.05%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化后，获得OK，以KSFM培养基培养，细胞融合达到90%时，以0.05%胰蛋白酶消化传代。取P1 OK，爬片，行免疫荧光检测细胞AE1/AE3的表达。
1.3 细胞移行速率的检测
将P3 ADSC和P1 OK种植到同一个刻度培养皿的两端，每日定时检测记录细胞的移行速率，作为对照，刻度培养皿两端均种植ADSC或OK，记录细胞移行速率。
1.4 细胞增殖速率的检测
在ADSC细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成ADSC条件培养基（ADSC-CM），培养OK细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。在OK细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成OK条件培养基（OK-CM），培养ADSC细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。同样检测正常培养条件下OK、ADSC的增殖速率。
2 结果
2.1 成功获取ADSC和OK
经酶消化法能够顺利获得ADSC和OK，ADSC呈纺锤形，少数有突起，为不规则状（图1左），细胞相互之间以细丝拉网。流式细胞检测表明CD90、CD34、CD44、CD105表达呈阳性，CD106、CD45表达呈阴性。OK细胞呈多角形，融合后的细胞呈现典型的“铺路石”样外观（图1中），细胞形态均一、稳定。免疫荧光见细胞AE1/AE3表达阳性（图1右）。
2.2 共培养环境下细胞移行速率升高
在单一培养环境下，ADSC移行速率为0.8～5.5 mm/d，共培养环境下ADSC的移行速率增高为0.8～6.8 mm/d。单一培养环境下，OK移行速率为0～1.5 mm/d，共培养环境下OK的移行速率增高为0.2～2.5 mm/d（图2）。
2.3 共培养环境下细胞增殖速率升高
MTT检测表明，与常规培养相比，ADSC-CM培养环境下OK细胞的增殖曲线明显变陡。同样，OK-CM培养环境下ADSC细胞的增殖曲线也呈变陡趋势（图3）。
3 讨论
作者：胡健 王强 雷宁玉 任莉 张娟
【摘要】 目的 新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮，为全角膜组织工程作基础。方法 采用组织块法培养兔角膜缘干细胞，以新鲜人羊膜为载体，形成单层细胞膜片后用于传代；采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果 培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出，之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞在羊膜上形成单层膜状，细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主；AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论 以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片，在传代细胞中，3代细胞分化程度最低、增殖能力最强，最适合移植。
【关键词】 角膜缘干细胞；新鲜羊膜；细胞培养
【Abstract】 Objective To produce rabbit corneal epithelium with cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion.Methods Rabbit limbal epithelium was cultured on human fresh amnion by tissue block method. It was passage time when the primary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 were detected on the primary and four generation cells with immunofluorescence. Contrast phase microscope was used to observe the appearance of cells.Results Cells outgrew from the limbal tissue block within 24 hours， then ‘sandy beach’ band formed， and confluent monolayer cell patch appeared when cultivated 7～8 days. The positive percentage of AE5 and p63 was (41.72±11.35)% and (21.57±6.36)% respectively in primary cells. Positive percentages of AE5 and p63 were no of statistical difference between the second generation cells and primary cells (P﹥0.05)， while there was significant difference between the third generation and primary cells(P﹤0.05)， and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion Corneal epithelium is produced with cultivation of rabbit limbal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations， the third generation cells are most suitable to be translated， because of the lowest differential degree and the strongest proliferative ability.
【Key words】 limbal stem cells，fresh amnion，cell culture
组织工程构建角膜上皮是组织工程化全角膜的课题之一。角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的来源，目前这一观点已经得到公认。种子细胞问题解决后，载体的选择已成为研究重点。本课题组采用新鲜羊膜负载培养角膜缘干细胞，为角膜上皮组织工程的载体选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织来源：兔眼取自健康纯系新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2～2.5 kg，由重庆医科大学动物中心提供，在实验前用0.25％氯霉素滴眼液点眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等传染病的剖腹产妇的胎盘。
1.1.2 主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），鼠抗兔单克隆AE5抗体（K3抗体）、鼠抗兔单克隆抗体p63（英国Abcam公司），免疫荧光染色试剂盒（Sigma公司），硝酸纤维素膜（北京鼎国生物制品公司），青霉素、链霉素、庆大霉素（上海生物工程技术服务有限公司）。
1.1.3 主要仪器：相差显微镜(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培养箱(2300型SHELDON美国)，眼科显微手术器材等。
1.2 方法
1.2.1 新鲜羊膜的制备：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的庆大霉素、青霉素500 U/ml、链霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20 min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，无血清）浸泡备用，所制羊膜均于取材后12 h内使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40 min，用细胞刮刀轻轻刮除上皮细胞，PBS清洗2次，相差显微镜下确认上皮细胞全部清除。上皮面朝上铺于盖玻片（22 mm×22 mm）上置于6孔培养板内。
1.2.2 兔角膜缘干细胞的原代培养（组织块法培养）：空气栓塞处死白兔，无菌条件下摘除眼球，去除角膜缘周围的附属组织，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜缘组织，剪成1 mm3组织块。用含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液消化15～20 min)，500 r/min离心后，弃去消化液，PBS清洗2次，将组织块置于羊膜上，每孔3块，间距0.5 cm，无菌静置10 min。含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，37℃、5%CO2培养，3 d换液，之后每2 d换液1次，形成单层细胞膜片后用于鉴定或传代。
1.2.3 角膜缘干细胞的传代纯化：相差显微镜下观察，待组织块生出的细胞形成单层膜片后，一般为8 d左右，将组织块取出置于另一羊膜上继续培养。PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min，含血清细胞培养液中止消化，轻轻吹打下的细胞收集入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞培养液制成细胞悬液，调整浓度至1×105copies/ml，接种于羊膜上，隔日换液，每2 d换液1次。如此传代3次，去除纤维细胞。待细胞基本长满后用于鉴定和移植。
1.2.4 角膜缘干细胞的鉴定［1］：免疫荧光鉴定：吸尽培养液，加入1 ml固定液，固定10 min。去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5 min，吸尽液体。用封闭液封闭60 min，在摇床上轻轻摇动。去封闭液，用稀释的一抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。4℃作用过夜。去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。去除洗涤液，加入1 ml稀释好的荧光标记的二抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，在荧光显微镜下观察荧光。
1.3 统计学方法 本实验数据均使用SPSS14.0统计软件进行分析，传代细胞与原代细胞AE5和p63抗体染色阳性比例间比较采用χ2检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 角膜缘干细胞原代培养与鉴定 相差显微镜下观察，在羊膜上培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞爬出（图1），大多为圆形、透明状。之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞形成单层膜状（图2），细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主。若继续培养至14 d左右，细胞成复层生长。
2.2 采用免疫荧光法鉴定原代培养的干细胞 AE5抗体染色阳性细胞质呈红色，阴性则不着色（图3）；p63抗体染色阳性细胞核呈绿色（图4）。羊膜上培养7 d的细胞AE5抗体阳性细胞比例为（41.72±11.35）%，p63抗体染色阳性细胞比例为（21.57±6.36）%。具体见表1。
2.3 传代纯化的角膜缘干细胞鉴定 经传代培养，与组织块原代培养时相比，相差显微镜下观察细胞形态较规整，成纤维状细胞明显减少（图5）。经免疫荧光鉴定，2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），AE5阳性细胞数明显减少（图6），p63阳性细胞数增多（图7）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。见表1。 表1 原代与传代角膜缘干细胞免疫荧光染色结果比较
3 讨论
组织工程化角膜是解决角膜移植供体来源最有前途的一个方法。载体是构建组织工程化角膜上皮的关键环节，合适的载体应可以促进体外角膜缘干细胞的生长，同时又便于培养的细胞移植。羊膜为胎盘最内层的半透明组织，研究表明，其作为角膜缘干细胞体外培养的载体并用于移植有许多优点：①能为正常角膜上皮生长、移行创造良好的条件。羊膜是人体中最厚的基底膜，含有高浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和糖蛋白，有利于上皮细胞的分化、移行，并能加强基底上皮细胞的附着和防止上皮细胞凋亡。②免疫原性弱。羊膜不含HLAA、B、C及DR等抗原成分，移植后不被宿主排斥，且在体内可降解［2］。③移植后可以阻止结膜化的发生。羊膜可诱导转化生长因子（TGF）β等细胞因子在创伤愈合中与成纤维细胞活动有关的信号下调，从而达到抗纤维化效果，减轻瘢痕形成。其中，TGFβ3还是干细胞生长的重要因子。④具有抗微生物特性，因此可降低移植术后感染的发生率。⑤羊膜还具有活跃的物质转运功能，能允许一些小分子物质如尿素、葡萄糖等通过。⑥羊膜来源广泛，制备成本低。以上特点使羊膜被认为是工程化角膜上皮的最佳载体［3］。本课题组采用去除上皮细胞的新鲜羊膜作为载体培养角膜缘干细胞，与其他文献报道相比，细胞生长速度较快，24 h即可见有细胞长出，7～8 d汇合成单层膜状。这可能与所用羊膜均为取材后12 h内，与干细胞生长相关细胞因子含量丰富有关。
目前对角膜缘干细胞标志物的研究已取得了一定的进展，但仍然缺乏具有特异性的标志物。Schermer等［4］的研究表明，K3蛋白是角膜上皮终末分化的标志性角蛋白，未表达K3是角膜缘干细胞的标志之一。Pellegrini等［5］证实角膜缘基底细胞抗p63抗体阳性，其他部位均阴性；能形成全克隆的细胞是干细胞，而全克隆细胞p63抗体阳性，故认为p63是角膜上皮干细胞的特异标志之一［6］。所以我们采用AE5抗体（K3抗体）和p63抗体行免疫荧光鉴定所培养细胞。本实验原代培养7 d羊膜上的细胞膜片中AE5阴性细胞较多，说明角膜缘组织块原代培养可获得维持于低分化状态的干细胞；而p63阳性细胞较多则说明细胞增殖能力很强。以新鲜羊膜为载体采用组织块法培养角膜缘组织可得到含角膜缘干细胞的细胞膜片。3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例明显高于原代。
但是实验过程中发现，角膜缘组织原代细胞中混杂有成纤维状细胞和其他分化成熟的细胞，且增殖速度高于角膜缘干细胞，培养超过2周则载体全被成纤维状细胞覆盖。因不同细胞贴壁程度不同，因此我们利用不同的消化时间将培养细胞传代克隆化，尽量去除成纤维状和其他杂细胞。结果表明，夹杂于干细胞间的成纤维状细胞明显减少。而且在本实验条件下，原代细胞浓度为1×105copies/ml传代，3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例最多，角膜缘干细胞纯度最高。但传代超过4代，角膜缘干细胞大部分同时表达AE5和p63，说明干细胞已经出现分化。
参考文献
［1］ 韩晓洁，龚岚，余振钰，等.人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定［J］.解剖科学进展，2005，11(1)：13. ［2］ Schwab IR.Cultured corneal epithelia for ocular surface disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc， 1999， 9(7): 891986.
［3］ 夏凉，赵敏.角膜缘干细胞培养的载体研究概况及进展［J］.中国实用眼科杂志，2005，23(12):12651268.
［4］ Schermer A， Galvin S， Sun TT．Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells［J］．J Cell Biol， 1986， 103(1): 4962.
组织工程一词最早是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的，其基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的、具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料上，经过一段时间的培养，将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位以形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。
组织工程的技术关键是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。这一三维空间为细胞的停泊、生长、繁衍、新陈代谢、新组织形成提供支持。作为组织工程细胞支架的生物材料应具备以下特性：良好的细胞亲和性；一定的孔径和互相沟通的三维孔结构；一定的几何形状；生物降解性，并最终被机体代谢或吸收。且支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利的影响，其降解速度与细胞的增殖速度相匹配；一定的柔韧性，使之既能同机体组织缝合并贴合，又不会对机体组织造成机械损伤等。
近来，丝素蛋白这种天然高分子纤维蛋白已广泛用于组织工程的研究。Altman等认为丝素蛋白具有如下优点：(1)与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；(2)在外科领域的应用已有很长历史；(3)可以通过不同处理方法获得膜或其他形态，而且工艺相对简单；(4)可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能；(5)在体内外可以缓慢降解；(6)对生物体无危险性。
本文综述了近年来国内外有关种子细胞在丝紊蛋白细胞培养支架方面的研究进展以及应用前景。
1 丝素蛋白在组织工程细胞培养支架方面的研究
1.1 软骨细胞 关节软骨损伤后其自身修复能力有限。近几年丝素蛋白应用于组织工程，为关节软骨的修复开拓了一个新的领域。日本京都大学和东邦大学(《国外纺织技术》2002年第6期)使用丝素蛋白培养兔软骨细胞获得成功。实验把丝素蛋白溶解在水里。加工成海绵状，其小孔直径约为80μm，然后把软骨细胞“种植”在上面，在37℃的温度下进行培养，2周后海绵状丝素蛋白的表面便再生出软骨组织。上海医科大学吴海涛等在2000年首次采用蚕丝与软骨细胞进行复合培养，探索了蚕丝作为软骨细胞体外培养支架的可行性，他们将胰蛋白酶消化后的蚕丝任意缠绕成网状，用聚乳酸活鼠尾胶进行包埋，制成三维支架，观察软骨细胞生长情况，发现蚕丝对软骨细胞具有良好的吸附作用，并能维持软骨细胞正常形态和功能，是适合软骨细胞立体培养的良好天然支架。
1.2 骨细胞 骨缺损的修复一直是骨组织工程中不断深人研究的重要和热门课题。治疗骨缺损最理想的植骨材料就是自体骨，然而，自体骨移植存在骨源有限、取材不便，取骨处受到削弱，增大感染概率.增加患者痛苦，不适宜于老年人和少年儿童等诸多问题。因此，寻找一种自体骨的替代材料成为骨组织工程的当务之急。Fini等应用丝素蛋白水凝胶促进兔松质骨缺损动物模型的组织修复，结果发现12周后丝素蛋白水凝胶促进松质骨缺损的修复且没有明显的炎症反应。以上研究表明，丝素蛋白水凝胶应用于承重骨骼的修复(如股骨、胫骨)具有广阔的前景。
Kaplan等在把丝素蛋白支架材料用于骨组织工程方面作了很多研究。他们采用静电纺的方法制得丝素蛋白纤维支架材料，在材料上复合BMP-2(骨形成蛋白)或HA(羟基磷灰石)颗粒，通过体外培养的方式观察骨的形成。研究表明，BMP-2在丝素蛋白纤维材料上上具有生物活性，复合了BMP-2的丝素蛋白支架材料能支持钙的沉积；丝素蛋白材料能支持hMSCs(人类骨髓间叶干细胞)的生长和分化，有利于骨形成；复合了HA的丝蛋白支架材料能够促进骨形成；复合了BMP-2和HA的支架材料能在很大程度上提高钙的沉积和改善BMP－2的转录水平。这种加入促进骨组织生长因子的支架材料是非常有潜力的骨组织工程材料，在支架材料中加入组织生长因子来促进组织形成的方法也是今后组织工程支架材料的发展方向。此后，Kaplan等把复合了hMSCs的丝素蛋白支架材料用于体内和体外培养，事实证明经过体外培养的hMSCs／丝素蛋白复合支架材料具有良好的成骨能力，能够治愈临界尺寸的骨缺损。
1.3 骨髓间充质干细胞 骨髓具有造血及成骨作用，分为造血和基质两个系统。骨髓基质系统是指骨髓腔内为造血系统提供结构及功能支持的结缔组织，含有少量的多能基质干细胞，研究表明骨髓基质干细胞具有多向分化潜能，在特定的条件下可以形成多种间充质细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及内皮细胞等。
Altman等将丝素蛋白纤维经特定的理化处理，在保证其抗拉强度下改善丝素蛋白纤维的弹性。形成接近于正常的前十字韧带结构的丝素蛋白基质材料，研究发现处理加工后的丝素蛋白三维支架同样支持间充质干细胞的黏附、增殖和分化，与间充质干细胞共培养2周时检测到韧带形成相关蛋白(Ⅲ型胶原、I型胶原、黏蛋白c)的转录水平明显增强，而成骨、成软骨相关基因未见明显改变，表明丝素蛋白支架促进了间充质干细胞向肌腱细胞的分化，且3周内未见丝素蛋白支架有明显的机械强度改变。Gregory等用经脱胶的家蚕丝素纤维制作人工十字韧带。将人类骨髓基质细胞(BM―SC)种植于支架材料上进行培养、扩增。扫描电镜、DNA定量测试和胶原含量测试等研究结果显示，此支架能支持人类干细胞向韧带系统的转化，同时此丝素蛋白支架也具有良好的力学性能和缓慢的降解性，有望打破前十字韧带临床治疗的局限性。
MeineI等和Kim等通过体内外一系列实验研究了间充质干细胞结合三维的丝素蛋白支架修复骨缺损。当培养基中加入含有骨形态发生蛋白2的成骨诱导培养基诱导后，反转录一聚合酶链反应检测到成骨相关基因的表达、免疫组织化学观察到钙沉积，同时发现接种于丝素蛋白支架上的间充质干细胞向成骨细胞分化明显提高。5周以后发现骨小梁的形成，随后将组织工程骨移植入骨缺损部位，同时移植接种间充质干细胞的丝素蛋白支架组、单一的丝素蛋白支架组和无移植物的空白对照组作为对照，移植5周后，工程骨和接种间充质干细胞的丝素蛋白支架组与周边组织良好融合，骨钙蛋白、骨桥蛋白染色呈阳性，工程骨组骨形成明显高于接种间充质干细胞的丝素蛋白支架组，骨小梁开始融合形成骨组织，类似于生理条件下的膜内成骨。
1.4 其他种子细胞在丝素蛋白细胞培养支架方面应用种子细胞在支架材料上黏附、代谢和增殖是组织工程研究的首要环节。Unger等报道了微孔的丝素蛋白无纺网材料能够支持人上皮细胞、内皮细胞、胶质细胞、角质化细胞、成骨细胞、成纤维细胞等的黏附、增殖、细胞间的相互作用等。同时他们还发现如果预涂上纤维连接蛋白，则观察到血管化作用中的内皮化现象。杨新林等探讨了人血管内皮细胞(HUVEC)在等离子体处理后的丝素蛋白膜表面的生长情况。结果发现SO2和NH3等离子体处理后，丝素蛋白膜表面分别被磺酸化和氨基化，并均能促进HUVEC细胞生长，而且对细胞形态和产生凝血因子的功能没有明显的影响，认为丝素蛋白是内皮细胞很好的培养基质。
此外，丝素蛋白支架在肝细胞组织工程中的应用也日益深入。KToyo take探讨了人体肝细胞在丝素膜上的体外培养。在丝素膜上播种肝细胞24 h后，观察到细胞沿基质表面和内部的网状结构作多重结构的附着。谷一草转氨酶(GOT)和谷一丙转氨酶(GPT)化验结果显示，接种1～7d，丝素膜上附着的肝细胞的COT和GPT活性值几乎没有降低，丝素膜上培养的肝细胞的氨处理能力和肝细胞白蛋白分泌能力也不低于目前最好的肝细胞培养基――胶原蛋白。另外，国内外诸多人士将人体平滑肌细胞、海马神经元、嗅鞘细胞、雪旺细胞、人类涎腺细胞植于化学修饰及改性的丝素蛋白材料，观察到丝素蛋白膜上生长的细胞贴壁良好，生长状况较好，证明了丝素蛋白材料具有良好的生物相容性。
2 前景展望
1. 下列有关基因及基因工程的叙述，正确的是（ ）
①基因是有遗传效应的DN段，全部位于染色体上
②检测到受体细胞含有目的基因就标志基因工程操作成功
③为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
④每一个基因都包含特定的碱基序列，具有特异性
⑤人体内的肝脏细胞和成熟红细胞所含的基因相同
A. ①②③ B. ③⑤ C. ②④ D. ④
2. 图①表示限制酶切割某生物DNA分子的过程；图②表示该生物体细胞部分基因和染色体的关系；该生物的黑色素产生需要如图③所示的3类基因参与控制，三类基因的控制均表现为完全显性。下列说法正确的是（ ）
A. 图①所示限制酶能识别的碱基序列是TTAA，切点在G和A之间
B. 用限制性内切酶可以从图②所示基因型的细胞中提取合成黑色素的所有目的基因
C. 图②所示的生物体中肯定存在含有2个a基因的细胞
D. 若图③中的1个b基因突变为B，则该生物体仍然可以合成出物质乙
3. 下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是（ ）
A. 卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加
B. 胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割
C. 胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点
D. 胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取
4. 下列关于生物工程的叙述中，不正确的是（ ）
A. 利用胚胎移植技术，可以加快优良种畜的繁育
B. 经诱导融合得到的杂种细胞，需经组织培养才能获得杂种植株
C. 人工合成法获得的人胰岛基因与体内该种基因的碱基排列顺序可能不完全相同
D. 利用DNA探针可检测出苯丙酮尿症和21三体综合征
5. 作物脱毒、改善畜产品的品质、抗除草剂作物、可保存的干扰素、检测有毒物质、性别鉴定依次是下列哪项生物技术的应用（ ）
①基因工程 ②细胞工程 ③蛋白质工程 ④胚胎工程
A. ②①①③②④ B. ①②②③④④
C. ②①②③②④ D. ②①②④③②
6. 下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（ ）
A. 用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞
B. 培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等
C. 动物细胞培养过程中多数细胞的基因型会发生改变
关键词：人才培养模式；细胞工程技术；教学改革
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）01-02-152-02
细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具[1]。就目前而言，高校细胞工程技术教学中还存在着一定的问题，如教学内容陈旧，不适合生物类企业对职员的知识和技能需求；教学方法还停留在高等教育的初级阶段，教学效果不高[2]等。因此，我们必须加快细胞工程技术类型人才培养模式的改革，进行细胞工程技术教学模式和课程的改革与创新，通过有效的教育模式来提高教学质量，让学生既掌握细胞工程关键技术的基本理论和基本方法，又能掌握细胞工程学科技发展中产生的新技术、新方法，提高学生的创新能力。笔者从教学内容与生产、双语教学、生产学习与实验技能几个方面对提高技能型人才培养目标的教学模式进行了探索研究，以期培养学生的学习能力、实践能力、创新能力，全面提高教学的质量和效率。
1 教学内容与生产整合
细胞工程学课程内容是按照细胞的主要结构及其功能、相关技术讲解的，课程包括细胞工程学发展史、细胞工程学概述、细胞培养及生物学特性、细胞融合、干细胞工程学、细胞克隆及克隆动物与转基因动物技术等；考虑到细胞培养技术在科研中普遍应用，目前细胞工程学实验课另外开设了免疫组化、荧光细胞染色与细胞分选、流式细胞仪操作技术、图像处理等课程。
本科学习中，细胞工程学教学中主要以各种细胞培养为主要线索，了解细胞工程技术具有特定的研究方式，使得他们对细胞工程学有一个全面的认识。例如，动物细胞工程技术应用于诊断和治疗疾病的单克隆抗体生产，有几千种单抗用于生化检测，而单抗用于人体疾病治疗是近几年来生物制药的一个重要领域，有几十种单抗药物正处于临床试验中。通过实验，学生理解单克隆抗体生产制备技术，并掌握原代及传代细胞培养技术、培养细胞的观察方法、细胞融合和分选技术等方法和常用设备的使用方法，为以后的生产研究做好准备。又如，动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。我们针对这个特点，启发同学设计较好的细胞大规模培养系统，如改装的灌流式培养方式，培养和启迪学生的创新思维。
2 普通教学与双语教学整合
在当前社会高速发展的时代，社会对细胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科学院校毕业的学生能否跟上时代的步伐，面向世界进行生物学的交流活动，扩大细胞工程技术在世界的影响，这是细胞工程技术发展至关重要的事。
在细胞工程学原版教材的选择上要力求最基础的专业知识内容水平。我们选择的教材是中国海洋大学出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，该教材的特点是讲授的内容比较全面，语法简单，对专业性的概念、词汇以及分子水平的知识进行了浅显的讲解，比较适合用于高等院校学生进行细胞工程专业外语的学习，避免学生由于英语基础差，导致对抽象晦涩的细胞工程学课程双语学习产生反感情绪，利于完成双语教学工作。
3 生产学习与实验技能整合
学生创新能力和实践能力的缺乏是高等教育教学改革面临的问题[3]。因此，要带领学生参与科学研究与生产实验技能，强化实践教学环节。细胞工程技术实践教学中，联系生物制品企业生产学习很重要，如我们带领学生到福瑞邦制药的厂家参观学习单抗制备，让学生注意在实验操作中可能失败的原因性，出现问题，及时加以纠正，培养学生良好的实践能力。针对细胞工程学的实验教学特点，穿插设计探索性和综合性的实验内容，并让学生自己参与到实验内容的设计，并调动学生的独立思考能力和创新思维能力，培养实验技能和创新思维能力。
实验大纲列出的实验项目较多，可整合为三大部分：（1）细胞培养综合实验。包括培养技术及细胞观察，细胞培养实验还可以将兔角膜上皮、基质及内皮细胞种植于生物材料上进行体外培养，观察培养细胞的生长、排列和细胞的粘附情况等。（2）经典单抗制备综合实验。将单抗制备产生过程中的细胞培养、动物免疫、细胞融合，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化，抗体检测5个实验内容整合为1个单抗制备设计性实验。教学中不为学生准备传统的实验讲义，只提出实验的任务、要求、进度及安全注意事项等，重点突出学生自行完成相关资料查阅，自拟设计方案，自己安排时间完成实验计划，获得实验结果，撰写实验报告。这个实验计划6个课时，2次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论与交流、实验结果课件汇报为主要内容。（3）流式细胞仪分选细胞综合实验。包括分选淋巴细胞或是干细胞的筛选，要求学生根据生产实践需要（如奶牛细胞的分选、白细胞计数及分选等）自己选择课题，自己设计实验方法以及最后鉴定。这个实验计划12个课时，4次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论、实验结果课件汇报为主要内容。所有实验的实验室全天性开放，学生可利用课余时间主动完成各项实验操作，老师指导，确保学生在30d内获得全部实验结果。老师可根据实验结果反馈及时调整教学进程和教学方法。通过学生的反馈，可以反映学生是否理解和掌握本课程的目标，并加强了教师与学生之间的沟通，提高了教学效果。
参考文献
[1]胡显文，肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位[J].生物技术通讯，2001，12（2）：117-122.