发布时间：2023-06-07 15:35:09
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的分子遗传学综述样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
【关键词】钉螺；血吸虫病；生物学特性；人工培养；综述
【中图分类号】R532．21【文献标识码】A【文章编号】1673－5234（2015）12－1148－03
血吸虫病（schistosomiasis）是一种严重的共患寄生虫病，呈全球分布。在我国主要流行的是日本血吸虫病。2013年全国共报告血吸虫病感染184943例，晚期血吸虫病患者29796例［1］，血吸虫病的流行位居水传播疾病之首，严重影响我国的社会经济发展和人类健康。钉螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸虫的唯一中间宿主，主要分布在亚洲东部和东南部，中国内地仅有湖北钉螺一种，钉螺分布与血吸虫病的流行息息相关。目前防控该病最常用的方法是消灭钉螺，人工培养钉螺对研究钉螺的生物学特性和筛选灭螺药物具有重要意义。本文对钉螺的生物学特性和人工培养的方法进行综述。
1钉螺的生物学特性
1．1形态学
钉螺为水陆两栖，常栖息于田间、池藻等淡水水域。它主要由螺壳和软体两部分组成，软体部分的前部为头、颈、足和外套膜，后部是内脏；表面有纵肋者称“肋壳钉螺”，壳长约10mm，宽约4mm。壳面光滑者称为“光壳钉螺”，比肋壳钉螺稍小，长、宽分别为6mm和3mm，多见于山丘地区。钉螺形态学特点主要包括形态特征、解剖结构等方面。钉螺早期的研究重点集中在钉螺内外部的形态结构变化，如螺壳形状、螺肋的数目及厣核的旋数［2］，并以此来认识与鉴别钉螺，如巴西钉螺被认为是光壳钉螺的一种，螺壳黑色，螺壳外唇无隆起线，壳光滑有黄色“假眉”，厣与齿舌与湖北钉螺相同［3］。钉螺的形态特征是研究钉螺的分类、遗传和进化的基础，分布于山区的光壳钉螺和分布于湖沼水网地区的肋壳钉螺生存条件不同。湖北钉螺具有遗传多样性，而且具有不同程度的遗传变异［4］。石朝辉等［5］通过对湖北庙河上下游钉螺调查发现，两个地区钉螺分别为光壳钉螺和肋壳钉螺，上下游螺群的遗传距离并无明显差异。
1．2分类学
钉螺俗称钉螺蛳，为动物界第二大动物门－软体动物门腹足纲中的一类，有雌雄之分。早期对钉螺分类的研究主要是以钉螺形态学和解剖学为依据的，自1913年宫入庆之助和铃木稔在日本证实光壳钉螺为日本血吸虫的中间宿主以来，对钉螺分类的依据主要是根据形态和解剖结构，如螺壳、螺厣和螺肋数目及齿舌形态特征。美国Bartsh根据螺旋数、齿式将钉螺分为Oncomelania、Katayama和Schistomophora［6］。有学者发现螺壳颜色、螺厣、齿舌等差异不大，认为钉螺的分类以形态结构为依据并不严谨［7－8］。近年来分子生物学技术的发展对钉螺分类的研究起到了重要作用。George等［9］通过对中国大陆不同地区、不同种群钉螺的同工酶进行比较，再结合螺壳形态学的基础将湖北钉螺再分成3个亚种：滇川亚种（O．h．robertsoni）、福建亚种（O．h．tangi）和湖北亚种（O．h．hupensis）。牛安欧等［10］利用单重复序列锚定PCR技术（SSR－PCR）将中国大陆7省的湖北钉螺分为4类。周艺彪等［11］采用微卫星锚定PCR分子技术对19个种群钉螺的基因DNA进行分析，进一步验证了中国大陆湖北钉螺分为滇川亚种、广西亚种、福建亚种和指名亚种等4个亚种。
1．3遗传学
钉螺的生物特征、地理分布以及日本血吸虫和钉螺之间的相容性都与钉螺遗传学特性密切相关。表观遗传学、分子遗传学和景观遗传学的研究应用在生物灭螺中起着不可替代的作用。早期，表观遗传学常用来作为钉螺分类依据，刘月英等［12－13］认为中国大陆钉螺属于一属一种，世界各地钉螺作为同一种属只有种下亚种和地理株之分，但种下具体如何分类尚未得到解决。随着分子生物学的发展，钉螺种群同工酶谱的分析、DNA基因序列的研究进一步得到发展。日本血吸虫与钉螺之间的相容性主要取决于两者之间的同工酶等位基因［14］，而且不同种群的钉螺对日本血吸虫的相容性不同［15］。周晓农等［16］研究了中国9省34个地区螺群的同工酶，结果表明钉螺种群间的变异程度较大，而同种群内的变异较小，肋壳钉螺的遗传变异分化程度小于光壳钉螺，且钉螺从喜马拉雅山脉扩散至世界各地，因环境变化，基因也发生了剧烈漂移。景观遗传学是在2003年由Manel［17］首次提出，其结合了景观生态学和种群遗传学的特点，意义在于研究物种微进化与景观环境之间的关系，为研究钉螺遗传变异分化提供了新的研究方法［18］。崔斌等［19］采用微卫星锚定技术对湖北松滋地区不同景观环境下钉螺遗传特性进行分析，结果表明湖北钉螺种群间遗传变异并不明显，而钉螺个体间变异显著。景观遗传学作为一门新兴学科，将人类及其活动纳入了研究范畴，在理论和方法方面有很大的发展空间。
1．4生态学
钉螺繁殖、分布及扩散等生态学特征与血吸虫病的流行息息相关。钉螺生态学的研究对血吸虫病的传播和预防可以起到理论指导作用。钉螺的生长繁殖易受灭螺药物和环境改变的影响，其分布密度与植被盖度有关［20］。林丹丹等［21］对鄱阳湖的自然环境进行研究发现植被总盖度与钉螺分布成正比，总盖度越高钉螺分布越广。地形是影响钉螺分布重要的因素之一，杨慧等［22］对云南地形的考察，发现云南地形以山区为主，呈孤岛性分布，扩散不明显，建议灭螺范围应以阳性钉螺分布地区为主，并适当扩大范围。钉螺的扩散方式主要以主动扩散和被动扩散为主，水流、光照强度、钉螺吸附能力以及水中障碍物均可影响钉螺的扩散［23］。此外，自然因素和社会因素如水灾、水利工程建设及旅游开发等也可影响钉螺分布与扩散。
1．5生理生化
钉螺的生理生化对研究灭螺药物的作用机制以及灭螺效果具有重要意义。杜小华等［24］用不同浓度的水和乙醇提取物配置成不同浓度的羊踯躅溶液进行灭杀钉螺实验，结果显示浓度不同的提取物处理钉螺后的灭杀率不同，其中以70％乙醇提取物灭杀钉螺的效果最佳。周康等［25］通过实验发现瑞香狼毒同上述几种药物一样对钉螺的主要能量代谢物质糖原有较强的抑制作用，而且以浓度为70％乙醇提取物的效果最好。黄春兰等［26］用硫酸、蒽酮比色法鉴定湖北钉螺各月份的肝、头足部肌肉和整体软体组织的糖原含量，结果表明整体软体组织和肝的糖原含量随着时间的推移而下降。吴明煜等［27］用不同浓度的蛇床子总香豆素处理液浸泡钉螺，在浸泡液处理的前96h内，钉螺体内糖原的含量随着浸泡时间的延长而降低，说明蛇床子总香豆素可以影响钉螺的糖原含量。胡彦龙等［28］研究发现田皂角甙当浓度超过0．80g／L时可以明显降低钉螺体内糖原含量，降低的幅度达12．49％～73．16％。刘金涛等［29］发现浓度大于0．85g／L的苦楝子可以降低钉螺内的糖原含量，降低幅度为10．78％～69．94％。过氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶是钉螺进行有氧呼吸的关键酶，抑制这些酶的合成可以有效地杀灭钉螺。顾文彪等［30－31］用苦楝叶提取液浸泡钉螺发现三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶降低，而一氧化氮合成酶增高，一氧化氮合酶的升高可以使NO合成增加，破坏钉螺机体内的线粒体氧化磷酸化，使能量合成受抑制，达到杀灭钉螺的效果。王万贤等［32］分别采取樟树的新鲜叶、茎皮和根皮调配成1％、0．5％、0．1％、0．05％等4个不同浓度的溶液处理钉螺，结果显示钉螺体内的过氧化物酶的活性随着浸泡的时间延长活性降低，其中以根皮的效果最好，叶的效果较差，建议大量种植樟树作为生态林可达到较好的抑螺效果。
2钉螺的人工培养研究
2．1钉螺螺卵的孵化和幼螺的生长
对于钉螺螺卵的孵化和幼螺的生长，主要的影响因素为温度、水和食物。钉螺螺卵的正常孵化需要在水中或是湿润的泥面上［33］，饲料以奶粉及复合动物饲料为主，其中藻类喂养幼螺存活率较高，达90％以上，且生长良好［34－35］。田建国等［36］采用了收集螺卵恒温孵化法、直接恒温孵化法和自然状态孵化法三种方法对钉螺螺卵进行孵化，结果显示泥土也可以影响钉螺螺卵的孵化。
2．2成螺的人工培养
成螺培养因实验目的不同，室内培养方法也不尽相同，常用室内培养感染性钉螺是泥盘草纸饲养法［37］。成螺培养主要为感染性钉螺，其中毛蚴感染钉螺的比例至关重要，张聪等［38］采用泥钵内铺细土泥法，按毛蚴与钉螺数量比为5：1、10：1、20：1三种不同比例进行感染，结果显示毛蚴感染的比例为10：1时，钉螺阳性感染率最高。
3结语
1.VT的临床特点及诊断技术：VT常起始于胫静脉或比目鱼肌的肌内静脉窦，且往往多发，易脱落至?静脉，股静脉及下腔静脉内，因多数栓子体积甚小，甚至脱落至肺动脉内亦无任何临床表现，而易被忽略，但如无防治则长期反复脱落栓塞至肺动脉，血栓机化后便形成慢性肺动脉栓塞，引起栓塞性肺动脉高压、肺心病，治疗棘手，预后较差。而在临床上，常引起我们注意的是一些有明显临床表现的下肢深静脉血栓栓塞，因其栓子较大，如连续几块栓子脱落栓塞于段以上的肺动脉则可引起致命性的临件发生，至少可在短时间内引起心肺功能恶化。但实际上前者发病率远高于后者。须指出很多患者虽因原发疾病而死亡，但慢性肺动脉栓塞常是使原发疾病难以纠正的重要原因。
临床常用VT检测手段包括下肢静脉阻抗容积图法、X线静脉造影及同位素静脉显像等，但目前便携式静脉彩色超声多谱勒仪因其方便、无创及灵敏度、特异性高而最受推崇，可应用于人群普查，为研究VT单位的必备设备。
2.明确VT与PE的关系：必须强调，VT是PE发生的标识。严格定义，PE是静脉系统（含右心）血栓形成后，在环境因素作用下脱落并栓塞于肺动脉而引起一系列病理生理变化的临床综合征，所以静脉血栓是PE的源头，而控制VT是防治PE的根本所在。
为了进一步阐明二者之间关系，国外已有通过尸检而确认PE栓子静脉来源的研究，其中欧洲的一组研究结果为：单个栓子来源排序分别是下肢静脉（52.7%）、盆腔静脉丛（32.1%）、右心（13.7%）、上肢静脉（1.5%）；多个栓子来源排序分别是下肢静脉和盆腔静脉丛（36.2%）、不同下肢静脉组合（31.9%）、下肢静脉和右心（10.6%）、盆腔静脉丛和右心（10.6%）；19%来源不详［1］。我国目前尚无此方面的报道，建议有条件的医院可以联合起来汇集尸检资料，分析我国PE栓子的来源静脉，对于国人PE防治有积极意义。
3.VT的危险因素：目前公认VT的危险因素分为遗传因素和环境因素两部分。
环境因素包括：年龄＞40岁、长期卧床、肿瘤、胸腹盆腔下肢或骨科手术、肥胖、静脉曲张、心力衰竭、心肌梗塞或脑卒中、糖尿病、骨折、炎症性肠病、肾病综合征、长期留置中心静脉导管、口服避孕药等［2，3］。
遗传因素目前是研究VT的热门领域，同样骨折或手术后患者，卧床时间相同，有的患者发生PE而有的患者未发生，原因既在于此。目前认为至少有12种基因参与，本文作者亦对此有较为详细的综述［4］。须着重强调的是活化的蛋白C抵抗即FV leiden，是目前最为肯定也是最常见的VT遗传危险因子，是V因子基因单点错意突变，即其基因核甘酸序列中1691位鸟嘌呤被腺嘌呤替代，导致其氨基酸序列中第506位精氨酸被谷酰氨代替［5］。但其与国人VT的关系，尚不清楚。目前虽可见在国人VT患者血中检测到FV leiden的报道，但仅一例，并不能说明其发生频率。
4.国人VT研究现状：目前我国匮乏大样本、正规的VT及PE的流行病学资料。最近虽有几组关于发病情况的报道也多是其医院内局域统计资料，对于人群防治价值有限。而血栓性疾病发病的地区、人种差异很大，不能完全引用国外的流行病学资料，尚有待我国国人资料的总结。令人鼓舞的是我院程显声教授领衔的“九五”攻关课题“肺栓塞的早期防治研究”已将VT的流行病学研究列为重要的分支课题，调查资料有望发表，将为国人VT的防治提供极为有价值的基线资料。
另外，国内研究VT者多为血液科医师与研究人员，规模较小，成果受限。因PE是一跨学科疾病，应学习国外模式，联合肺科、心脏科、血管外科、流行病学家、社区全科医师等，形成正规研究团体，才可能对国人VT与PE防治作出有意义的工作。
5.VT的预防措施：根据国外经验，常用的VT预 防措施有以下几种：(1)目前推荐最有效的预防措施为在以上提到的高危人群中应用低分子量肝素或普通肝素。有报道可使VT发生率由25%降为8%，使大块PE发生率降低50%［6，7］。(2)间歇空气加压：在高危患者的下肢用气压袖带每分钟加压35～40 mm Hg×10 s (1 mm Hg=0.133 kPa)，目前认为可以减少静脉血栓的形成［6］。(3)有人推荐使用弹性袜预防VT，但无流行病学资料证实其有效性。(4)右旋糖苷：其预防VT发生不如肝素有效，但可进一步阻止VT的发展而减少PE［6，8］，其作用机制可能是阻止血栓进一步增大和脱落［9］。(5)阿司匹林：曾有研究否认了阿司匹林对VT的预防作用，但最近一项较大规模临床试验证实其可使VT发生率较对照组减少37%，PE发生减少71%［10］。且阿司匹林使用方便，价格便宜，适合各级医师包括初级保健医师、农村医师使用。(6)华法令虽然有效，但监测烦琐，作用时间较难控制，不推荐常规使用。
6.VT预防工作尚未广泛开展的原因：在美国，96%的外科医师都同意在术中、术后广泛使用各种措施预防VT［6］，而在国内尚未广泛开展，其原因有以下几条：(1)误以为发生率低；(2) 恐惧出血的副作用；(3)担忧医疗费用增加（没有计算治疗PE的高额费用）；(4)感知困难：出血令人难忘，抗凝的益处却很难直接感知；(5)对发生的后果估计不足。这提示我们需要加强宣传，提高全体医师包括县级基层医院医师防治VT的意识。
VT的研究与防治在我国是一项很重要的卫生保健任务。总体来说，目前我国相关研究与国外相比，差距很大，仅有零星个案报道，急需组织一支由多学科研究人员共同组成的专业研究团体，专门从事其临床研究工作，争取从分子遗传学、遗传流行病学、人群筛查技术、初级及二级预防措施的推广等多方面有所突破，从而为总体降低PE的发生打下基础。
参考文献
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关键词：妊娠高血压疾病 发病学 研究进展
中图分类号：R711 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）10-0222-03
母亲安全、儿童优先是围生医学永恒的主题。该主题的初级目标是降低孕产妇和围生儿死亡率，中期目标是降低母婴发病率和残疾率，终期目标是提高人口素质[1]。
妊娠期高血压疾病的发病学及机制的不清目前仍然困扰着全球产科。由该病引起的孕产妇及围生儿的死亡率和并发症也一直威胁着女性健康。由于现代实验方法的进步，在研究过程中发现了很多与妊娠高血压疾病的发生、发展相关的因子，从而建立了许多学说，本文从以下几个方面来综述：
1 发病学研究的概述
尽管妊娠高血压疾病的病因研究已有100多年的历史，通过无数学者不懈的努力但至今仍未很清楚的阐明。其病理生理学改变广泛而复杂，包括全身血管痉挛、凝血系统的激活及止血机制异常，前列环素与血栓素比值的改变等。这些异常的改变导致多器官系统血管的病理损害（如肾、肝、心、脑及子宫胎盘血管床），结果可引起胎儿生长迟缓、死胎、早产、围产期窒息，孕妇也容易并发胎盘早剥、抽搐、颅内出血、肺水肿及肝肾功能衰竭等。近年来，随着医学基础理论特别是分子生物学的研究进展，使妊娠高血压疾病从发病学的研究到病理生理变化取得了新的突破。
2 发病学研究的机制与学说
2.1胎盘或滋养叶细胞缺血学说：
早在1918年，Young首先提出子宫缺血学说，其支持理由在于妊娠高血压疾病多发生于：（1）子宫内压增高的患者；（2）合并有全身血管病变的孕妇；（3）先天性动脉发育畸形的患者。以后通过许多学者的实验证明，子宫—胎盘缺血学说获得公认。后来又从葡萄胎可并发妊娠高血压疾病的现实得到启示，胎盘缺血关键可能在于滋养叶细胞缺血。
滋养叶细胞缺血与早孕期子宫胎盘血管床发育受阻有关。提示早孕期滋养叶细胞缺氧，可能是导致子宫胎盘血管床发育受阻的重要原因。目前又称这种病理现象为胎盘浅表着床或缺陷胎盘。
2.2高同型半胱氨酸血症与血管内皮损伤学说：
近年来，动物试验证实，高同型半胱氨酸血症可诱发孕鼠产生妊娠期高血压疾病的典型改变[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血压疾病发病学研究的热点。高同型半胱氨酸可能导致妊娠期高血压疾病的机制：高同型半胱氨酸促进氧自由基的生成，使氧化还原系统平衡失调，呈现氧化应激状态，导致血管内皮细胞受损，继而引发小动脉痉挛等一系列病理生理改变，符合妊娠期高血压疾病的发病机制[3]，动物试验通过给予蛋氨酸负荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸动物模型显示，血浆一氧化氮浓度较试验前明显降低，证实了高同型半胱氨酸血症对血管内皮功能的损害作用[4]。高浓度的同型半胱氨酸及其产生的过氧化物超过了细胞的清除能力，破环了细胞的防御性保护反应,导致内皮细胞损伤。实验研究发现高同型半胱氨酸血管内皮损伤的特殊标志物：血管内皮损伤因子[5]，血管细胞粘附因子21，纤维结合素[6]，均生成增加[7]。研究还表明，早发型重度子痫前期患者血清同型半胱氨酸显著高于晚发型重度子痫前期组及正常妊娠组[8]。所以，研究证明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血压疾病内皮细胞损伤中起着很重要的作用。目前认为，血管内皮具有多种重要的生理功能。一旦血管内皮受损可导致血管通透性增加，体液与旦白升高，抗凝血因子和血管扩张因子减少，在受损部位引发促凝血因子合成和激活凝血系统，最终导致血小板凝聚及血栓形成并释放有丝分裂元，其中主要的有血小板衍生生长因子，这是一种很强的血管收缩因子。因此，血管内皮损伤是目前提出普遍公认的妊娠高血压疾病的主要发病机理。
2.3免疫学说：
从免疫学角度看来，胚胎是一半同种异体移植物，妊娠成功有赖于胎儿——母亲间的免疫平衡，而这种平衡一旦失调，就可能引发排斥反应，导致病理妊娠，如妊娠高血压疾病。目前支持妊娠高血压疾病与排斥反应有关的证据主要是，患者子宫螺旋小动脉存在着类似于肾移植排斥反应所出现的典型的血管炎病变，即螺旋小动脉急性粥样硬化。这一点为过去和近年来国内外研究反复证实。
2.4遗传学说：
从临床观察，妊娠高血压疾病存在着明显的遗传倾向，即有妊娠高血压疾病家族史的孕妇，妊娠高血压疾病发病率明显高于无家族史的孕妇。
从分子学水平对本病进行探讨发现，采用血清学方法检测，妊娠高血压疾病患者白细胞抗原（HRA）DR4频率明显增高。PCR和地高辛标记寡核苷酸探针杂交技术，探查H41—DRB1基因座位，也证实妊娠高血压疾病HLA—DR4抗原频率增高和母亲、胎儿HLA—DR4抗原相容性增加有关，同时还发现等位基因0405基因频率也明显增加。这些表明，妊娠高血压疾病至少与HLA—DR4相关。妊娠高血压疾病分子遗传学的研究，还有待深入。
关键词 番木瓜；遗传改良；研究进展
番木瓜属番木瓜科多年生常绿小乔木，是热带、亚热带地区广泛栽培的热带名果之一，在我国约有70多年的栽培历史。目前，番木瓜的种植模式、病害控制和种苗生产等问题仍是番木瓜种植和推广的主要障碍。近50年来，离体培养、杂交育种、人工诱变育种、基因工程等现代遗传育种学及生物技术的发展，为解决这些难题提供了新的途径。笔者就生物技术及各育种手段在番木瓜研究中的应用进行综述。
1番木瓜的离体培养
离体培养就是利用体细胞进行无性繁殖的一种方法。在离体培养中外植体的选择相当广泛，根、叶柄、茎段、子叶、胚珠、幼胚等都被相继用来进行不同目的的离体培养研究。目前，国外已经有许多关于番木瓜离体繁殖体系、体细胞胚胎和器官发生、芽体繁殖、细胞原生质体培养等方面的报道。例如早在1978年，Litz[1]等用花药悬浮液体培养诱导番木瓜单倍体获得了0.1%的再生频率，证实利用花药或花粉培养番木瓜单倍体是可行的。Fredah[2]等通过花药培养诱导番木瓜胚的形成，结果发现花药培养得到的番木瓜植株绝大部分是雌性株，可用以繁殖雌性的番木瓜。1974年，DeBruijne[3]等首次报道了以番木瓜的叶柄诱导形成愈伤组织，并产生了体细胞胚，但未报道体细胞胚是否培养出小植株。Litz等人在1977年[4]，用番木瓜的茎尖和叶柄在MS和White培养基上获得了试管株系；1982年[5]，他们又从胚珠产生的愈伤组织诱导产生体细胞胚并获得再生植株；1983年[6]，他们通过培养番木瓜胚珠获得了大量体胚并长成苗。1987年[7-8]，Drew和Chen等也分别从根外植体诱导产生体细胞胚和再生植株。此外，Fitch等[9-10]分别以幼胚、下胚轴为外植体诱导产生了体细胞胚，并实现了植株再生。
近年来，随着组织培养技术的迅速发展及其与分子生物学各学科领域交叉结合的发展，国内也有不少学者对番木瓜的离体培养进行了研究。如叶克难等[11]以根、茎为外植体进行悬浮培养后，获得了大量体细胞胚产生的再生植株；朱西儒等[12]以叶为外植体诱导产生了胚性愈伤组织并获得再生植株；曾继吾等[13]以子叶和幼胚2种不同的外植体诱导产生愈伤组织，结果2种来源的愈伤组织均能诱导成胚性愈伤组织并形成完整的植株，而且体细胞胚的发生率决定于外植体和培养基的激素成分。此外，邹韵霞等[14]报道，在番木瓜受精胚珠诱导体细胞胚发生的过程中，NAA+BA+GA3组合诱导效果最佳，能获得理想的胚性愈伤组织和体细胞胚。林治良等[15]和周鹏等[16-17]以番木瓜侧芽作为外植体，分别在MS和BM培养基上建立了试管离体繁殖体系。蔡英卿等[18]报道了外植体、糖类、激素、有机物、光照等因素对番木瓜体胚诱导的影响。
2番木瓜的杂交育种
杂交育种是在各种粮食作物、经济作物、水果蔬菜等作物上应用广泛且取得了良好成效的常规育种手段之一。在番木瓜的杂交育种中，国内外已选育出许多优良的栽培品种[19]，如广州市果树研究所先后选育出穗中红、美中红、优8等优良品种[20]。但一直以来，番木瓜病毒病是限制番木瓜大面积种植和发展利用的最大因素之一，在已报道的近10种番木瓜病毒病中，番木瓜环斑病（PRV）危害最严重。除了报道的少数抗PRV的杂交种和仅有的3种抗PRV的野生种（茎花番木瓜、托叶番木瓜和有毛山番木瓜）外，几乎所有的番木瓜栽培品种都不能抵抗PRV的危害[21]。但由于这3种野生种不仅不能食用，而且与C.papaya存在不同程度的杂交不亲和性，这无疑给番木瓜的杂交育种工作带来了困难，难以很好地利用天然抗PRV的基因。
近年来，番木瓜实验胚胎学、酶学等研究的不断发展，已有一些学者成功地获得了一些有利的杂交品种。如夏威夷大学的Manshardt和Wenslaff[22]在杂交试验中，以3个C.papaya株系（Kapaho、Hawaii和Washington）和2个C.caulofora株系（UH345和UH372）为亲本，全部组合的种间互交后，结果只有UH345为母本的组合能够产生发育成熟的合子胚。Moore等[23]通过同工酶和PAGE检测得到源于C.papaya×C.caulofora杂种胚性愈伤组织的体细胞植株，经过分析其相应的染色图谱，确定该体细胞胚再生植株是种间杂种的后代。后来，Chen等[24]在实验中也证实了C.papaya×C.caulofora杂种胚的再生植株具有种间杂种的真实性。朱西儒等[25]在番木瓜杂交育种实验中获得了2个较好的杂交组合，杂交后代的抗病性有所提高。黄建昌等[21]也通过轮回选择方式，用多个组合进行种内杂交，获得抗病性较强的杂交后代。
3番木瓜的基因工程育种
长期以来，番木瓜都面临着病毒病的危害，尤其是PRV，但由于传统防治方法有着诸多的缺陷，防治效果并不理想。利用基因工程进行抗病品种的培育是防治和治理病毒病的根本途径。目前番木瓜基因工程育种主要采取2种策略：一是直接分离克隆抗PRV基因，将之转入番木瓜基因组中，使之获得抗性；二是将PRV病毒外壳蛋白或核酸酶基因转入番木瓜中，使之获得抗性[26]。1990年，Fitch等[9]建立了以番木瓜胚性愈伤组织为受体的共培养转化体系，并通过体细胞胚发生获得了2株表达HA5-1的转基因植株，进一步的繁殖扩增成为2个品系。1992年，Fitch等[27]用基因枪法把构建在PG482GG的HA5-1CP的嵌合基因导入番木瓜，获得5个转基因品系，其中1个品系为高抗PRV株系，在田间种植2a都不发病。我国学者[28-29]通过酶联吸附免疫、点杂交等分子遗传学手段，也先后得到转番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRAC-CP）植株及转环斑病毒外壳蛋白基因和核酸酶基因（PRSV-CP-SN）植株。叶长明等[30-31]首次将PRV复制酶（RP）突变体基因导入番木瓜获得转基因抗病品系；随后，叶长明等[32]通过对RP基因分析，证实了转PRV RP基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫，RP基因可稳定遗传并在RNA水平上表达。Tennant等[33]发现转基因番木瓜Rainbow和Sunup都抗夏威夷品种PRSV的分离物。Chiang等[34]构建了一系列重组PRSV来接种转PRSV-CP基因的Rainbow，结果表明，要获得抗PRSV不同株系的广谱抗性的转基因番木瓜，在构建时应包括CP基因的完整编码区及3′非编码区。此外，还有众多学者也开展了番木瓜转基因的研究[35-38]。
除了对番木瓜病毒病的转基因研究外，还有一些学者利用分子生物学的方法对番木瓜进行了性别的鉴定以及遗传变异的研究。Sonsri等[39]用DNA扩增指纹（DAF）技术对番木瓜性别基因标记进行了研究，虽然找到了多个性别相关的标记，但未进行遗传连锁分析。Sordur等[40]也曾用RAPD技术构建了1个番木瓜遗传连锁图谱，其中在性别决定座位两边各有1个标记，但遗传距离为7cm。周国辉等[41]应用BSA法确立了2个与番木瓜两性基因紧密连锁的RAPD标记，它们与两性基因的遗传距离分别为4.5cm和1.9cm，为番木瓜性别基因的精细定位和克隆打下了良好的基础。陈中海等[42]在实验中，应用同工酶（POD、EST、PPO）、蛋白质的SDS-PAGE以及RAPD标记三方面研究番木瓜雌株、雄株和两性株之间的差异，结果表明以上标记均可较准确地鉴别出番木瓜的雌、雄株，可作为对番木瓜进行性别鉴定的参考。Kim等[43]通过AFLP标记揭示了C.papaya的遗传多样性，该结果表明异花授粉的雌雄同体植株具有类似异花授粉雌雄异体植株的变异性；C.papaya与其余6个栽培品种也具有少量的遗传相似性，其平均值为0.432；而6个栽培品种间的遗传相似性的平均值则可达0.729，由此可推测，C.papaya可能是由其余6个品种早期的基因进化而来的。
4问题与展望
尽管番木瓜遗传改良的各方面都取得了一些进展，但在实际生产上仍有许多问题，如抗病、抗寒、优质及其稳定性等未得到根本的解决。因此，利用目前组织培养技术及分子生物学等学科领域的发展技术，不仅可以从分子水平上认识这些问题，而且还可以通过各种手段来生产经遗传改良的番木瓜品种。如选育能广泛栽培的抗寒品种，通过可能的育种手段改善果实风味；运用基因工程技术引入外源基因，将可以有目的地提高其抗性以及调控果实代谢的相关过程，解决番木瓜果实后熟迅速、易损伤腐烂、不耐贮藏的缺陷。也曾有学者报道，雌雄异株、株性高度杂合、对病毒敏感是制约番木瓜遗传改良的三大客观因素。这些不利因素给番木瓜的大面积种植和杂交育种的后代选择及性状稳定带来了困难，因此采用组织培养技术繁殖具有优良性状及抗病基因型的品种是克服番木瓜实生苗后代变异、植株感病以及生产大量优质种苗的好方法。在印度和我国台湾，这种方法已得到系统研究和生产验证。
目前国内外许多育种学家正努力通过分子标记技术来对番木瓜的基因进行探查，对番木瓜的遗传基础及遗传规律的认识正在逐步加深。实验胚胎学、细胞遗传学、形态解剖学及组织培养技术的不断发展，使得远缘杂交育种获得杂种后代，从远缘品种中导入抗病基因成为可能；同时，通过人工诱变技术获得抗性突变体也是一条较理想的育种途径。此外，基因工程技术的应用也可以进一步导入抗病基因及其他有用的基因。可以预见，随着现代生物技术和信息技术手段的发展及广泛应用，番木瓜的遗传改良将会取得更大的突破，从而对促进番木瓜的长足发展具有重要意义。
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胰腺癌是发展迅速且预后不良的恶性肿瘤,手术切除率较低,术后复发率高,对化疗不敏感,目前尚无理想疗方法。随着分子遗传学和基因工程技术的飞速发展,基因治疗逐渐开始应用于临床疾病的研究,近年对自杀基因在肿瘤治疗中的作用研究颇多，本文就胰腺癌自杀基因疗法研究的新进展做一综述。
一、 自杀基因治疗
将自杀基因转导入肿瘤细胞,再用相应的药物前体或细胞毒因子,前者通过自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物或细胞毒因子与其受体结合,从而达到杀死肿瘤细胞的目的,以前又称为肿瘤的药物基因治疗,也有称为病毒介导的酶解药物前体疗法(vius directed enzyme prodrug therapy,VDEPT)［1］
二、 自杀基因治疗的作用机制
代谢产物的直接毒性作用 通过分子生物学技术将自杀基因转导至肿瘤细胞中,然后全身或局部注射无毒、低毒的前体化疗药物,由于肿瘤组织中表达“自杀”基因,编码酶将前体化疗药物转化为具有杀肿瘤作用的毒性代谢产物,在肿瘤局部形成一个药物浓聚区,可以增强疗效,并减弱化疗药物的全身毒副作用,达到选择性杀伤肿瘤的目的。
三、 胰腺癌的自杀基因几种治疗模型
(一) 单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及其底物丙氧鸟苷丙氧鸟苷HSV TK基因/GCV HSV
CD基因编码的胞嘧啶脱氨酶,可将胞嘧啶代谢为尿嘧啶,使5-Fc转化为细胞毒性代谢产物5-Fu,从而发挥细胞毒作用。TK基因治疗胰腺癌是通过这种基因编码的胸苷激酶特异地将核苷类似物药物前体,如羟甲基无环鸟苷(Ganciclovir,GCV)磷酸化,进而在细胞进一步代谢成三磷酸GCV,后者可抑制细胞DNA聚合酶的功能或竞争性地渗入细胞DNA造成DNA合成终止使细胞死亡。
近年来,HSV TK基因较广泛地应用于胰腺癌治疗研究中,Block A等［3］用HSV TK基因/GCV治疗胰腺癌肝转移动物模型,结果体外生长的胰腺癌细胞高效表达HSV TK基因,并显示了“旁观者效应”;荷瘤鼠瘤内注射HSV TK,继之使用GCV 8天,肝转移瘤明显缩小、坏死。显示了HSV TK基因杀伤胰腺癌细胞的作用。。Aoki K［4］在HSV TK基因下游加上一个杂交的强启动子CAG,结果14只荷瘤鼠中8只肿块消失,其余6只鼠瘤块明显缩小,而24只对照鼠肿块无变化,且该研究治疗中,未发现任何毒性反应。基因治疗的靶向性是关系到基因治疗的效果问题之一。
（二） EC CD基因/5 FC
EC CD基因可将无毒性的药物前体5 氟胞嘧啶(5 Fuorocytosine,5-FC)代谢成抗DNA合成的化疗药5-Fu,使肿瘤局部药物浓度增加,达到杀死肿瘤细胞,减轻毒性作用的目的,Autin等最早分离、克隆编码了EC CD基因,并用逆转录病毒介导转染结肠癌细胞,结果转导的肿瘤细胞被杀伤。Evoy D等，将该方法用于胰腺癌的治疗研究,表明了EC CD/5 FC的抗肿瘤作用。同样也观察到“旁观者效应”使抗肿瘤作用加强。
四、 联合基因治疗
（一） 联合抑癌基因治疗 融合自杀基因治疗是利用基因工程技术将自杀基因和另一种基因连接在一起,以增强自杀基因治疗肿瘤的效果。
P 53是一种抑癌基因, Cascallom等发现,野生型P53基因转导能增强吉西他滨和顺铂对胰腺癌细胞的化疗效果,Mercade等以实验表明P53基因转导对自杀基因治疗疗效的增强作用,估计与P53能够识别破坏的DNA,增强化疗对肿瘤的抑制作用有关。
转染双自杀基因至SW1990细胞在体外实验治疗中取得了较好的效果,但在体内的应用还有很多局限性,而且有资料显示胰腺癌细胞对于许多化疗药物存在固有不敏感性.
（二） 联合细胞因子基因治疗 转移细胞因子基因可以诱发机体强大的抗肿瘤免疫,其中IL18基因作用较突出。CD基因和IL18基因联合转移后,可以协同发挥抗肿瘤作用,克服两者单独使用的不足之处,提高机体对肿瘤的细胞免疫应答,增加机体的非特异性和特异性抗肿瘤作用。
某些细胞因子对恶性肿瘤有杀伤作用,目前已有关于联合自杀基因与细胞因子基因治疗的报道,Judw等在大肠癌细胞的CD/5 Fc治疗模型中,转染淋巴肌动蛋白基因进入瘤细胞,发现可以增强机体抗肿瘤免疫应答,增加自杀基因的疗效;SakaiY等在肝细胞癌的HSV tk/GCV治疗模型中,辅以单核趋化蛋白 1基因治疗,同样增强了GCV的疗效。目前胰腺癌中此项研究尚无报道。
五、 总结
综上所述,自杀基因治疗应用于胰腺癌等消化道肿瘤的辅助治疗已经取得了很多成果,但要应用于胰腺癌的临床治疗则还有许多问题尚待解决,如基因治疗的安全性、转导效率还不够高,药物的最佳使用时间以及如何增加疗效等。目前研究的重点是:(1)逐步从体外实验向体内实验过渡,观察自杀基因治疗对大体积肿瘤的疗效;(2)解决临床应用的安全性问题,这也是所有基因治疗的共同问题。随着研究的进一步深入,自杀基因治疗必将会成为一种有效的胰腺癌辅助治疗手段。
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然而由于种种原因，近年来，作为衡量硕士研究生培养水平重要指标的硕士学位论文的质量却不尽如人意。硕士研究生学位论文目标不明、内容空泛、层次不清、推理不严，以及答辩准备不充分的现象十分普遍。目前，如何提高研究生学位论文质量的问题已引起了各高校学者与专家们的广泛关注。陶勇等[1]对农科专业硕士学位论文写作中存在的问题及原因进行了全面深入的分析，认为从实验内容到具体写作，都存在或大或小的问题，而研究生与指导教师长期不懈的努力是逐步提高学位论文水平和研究生素质的关键。首都经济贸易大学工商管理学院院长黄津孚则认为[2]要提高硕士论文的质量，必须从学风、导师和制度抓起。笔者拟就如何提高农业院校研究生学位论文质量的问题，谈几点认识。
坚持“化整为零”的原则
坚持“化整为零”的原则，即打破毕业前半年才开始着手撰写毕业论文的传统观念，在入学初即告诉学生硕士学位论文写作的一般程序和规范，帮助学生合理规划三年的学习时间，将毕业论文化整为零的完成。督促学生从入学的第一天就要天天、月月、年年想到毕业论文的撰写，时时处处为毕业论文的撰写做准备。这样既可以增加学生的紧迫感，培养学生统筹安排的能力，同时也有利于学生主动将基本理论，基本知识的学习与科研实际相结合。首先，要求学生利用课余时间，在前期基础课学习的过程中完成大量文献的查阅工作，在入学半年后提交所选研究方向国内外研究现状和实验方法的综述，为写好硕士毕业论文的前言、材料与方法以及参考文献部分奠定坚实的基础。解决学生因毕业论文撰写时间仓促，导致质量偏低的现象。
坚持 “三早”的原则
坚持贯彻“三早”原则，也就是早选题，早定题，早开题的原则。在学生入学初，准备好一系列与导师研究相关的题目，比如：大豆油分研究；大豆蛋白质品质研究；大豆加工适应性品质研究；大豆种质开发研究；大豆基因组研究等等，供学生按照自己的爱好选择课题，激发学生的主题意识和主动发展的愿望。督促学生尽快选定研究方向，尽早开始文献查阅。定期给予学生指导，培养学生掌握科技文献检索、资料查询与阅读的方法和能力，同时指导学生对查阅过的文献的题目，来源等等按照参考文献的正规格式进行相应的详细记录，以备最后集中撰写论文时，有的放矢，从而避免学生随意堆砌参考文献，甚至从网上下载，直接粘贴的现象。要求学生在入学半年后必须提交合格的开题报告，彻底改变学生不读书，不了解学科动态的状况。
坚持“步步为营、不欠账”的原则
农业生物技术专业具有季节性强，生育周期长的特点，因此，要想保证论文的各个环节都有充分的时间得以保质保量的完成，在尽早开始进入试验状态的前提下，还要督促学生坚持做到“步步为营，不欠账”，也就是要根据开题报告中工作进度计划的安排，认真做好每一个阶段的工作，比如，播种期做好播种计划，适时播种，生育期做好各项生理指标的检测，在秋冬季进行分子遗传学室内分析等，对每一个阶段的工作，数据要及时进行整理，总结，及时发现问题，及时解决问题，坚决杜绝将所有的原始数据堆积到最后分析。防止一旦发现问题，又没有可能在短时间内补救，只好编造数据的现象。保证研究生如期完成学位论文的撰写，充分准备，做好毕业论文的答辩。
三个“坚持”原则的贯彻可以全面提高学生的综合能力和素质。对于培养富有创新精神和实践能力的人才具有重要的意义。首先，通过督促学生查阅大量的文献，可以解决学生不读书，不了解学科动态的问题，同时帮助学生拓宽相关知识面；其次，通过对试验设计、试验实施的过程严把质量关，可以培养学生科学的态度及科学研究的能力，加强对研究生研究方法的教育，提高研究生的学术水平。第三，通过把好数据分析，论文撰写及论文答辩的质量关，可以提高学生的写作水平，信息处理能力以及语言表达能力。三个“坚持”原则的贯彻使得提高硕士研究生学位论文质量的工作落到实处，水到渠成的使学生具备了农业现代化生产所急需的创造型人才必须具备的各项基本技能。
参考文献：
关键词：食管癌 癌基因 抑癌基因
中图分类号：R34 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）10（a）-0020-03
Research on the Changes of Genes in Esophageal cancer
GUAN Xuan WU Jin
（1.School of Basic Medical Sciences， Chengdu Medical College， Sichuan Chengdu ，610500， China；2. Preclinical and Forensic Medicine， Sichuan University， Sichuan Chengdu，610041，China）
Department of Forensic Biology， Sichuan University， Chengdu 610041， China Abstract The onset and development of esophageal cancer is affected by multiple factors. Functional variations of genes may be one of the most important factors. To help the readers understand the importance of oncogenes and cancer suppressor genes in the diagnosis， treatment， prognosis and prevention of esophageal cancer， this review introduces current state of knowledge about the association between genes and esophageal cancer， and the underlying mechanisms.
Key words：esophageal cancer oncogene cancer suppressor gene
食道癌是常见的消化道恶性肿瘤，死亡率居各种癌症的第6位[1]。主要有鳞癌和腺癌两种形式。食道癌的发生发展是一个涉及多因素、多阶段、多基因变异积累及相互作用的过程[2，3]。目前研究认为，在细胞癌变过程中，癌基因的激活和抑癌基因的失活可能是细胞癌变的分子基础，细胞凋亡相关基因和肿瘤转移抑制基因异常等也与之有关[4]。因此，加强对食道癌特异的分子遗传学学变化的研究，不仅有助于阐明其发生、发展的机制，而且对临床治疗也有一定的指导作用。
癌基因（oncogene）是人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，又称转化基因，它们一旦活化便能促使人或动物的正常细胞发生癌变。抑癌基因（cancer suppressor genes）是指产生直接或间接抑制细胞增殖、癌变的肿瘤抑制基因，其在肿瘤的发生、治疗与预后中发挥着重要作用。
癌基因和抑癌基因的研究对于食道癌的早期诊断、判断预后、治疗及预防等方面都有重要的意义，将会为食道癌的诊断与治疗提供科学的分子基础和理论依据。
1 癌基因
1.1 myc基因
myc族基因是白基因家族，为细胞内的原癌基因，基因定位于8q23，主要包括C-myc，L-myc，N-myc。较多的研究证实其表达与细胞增生、肿瘤发生、发展密切相关。Sarbia等[5]通过对食道癌发生不同阶段的C-myc表达情况进行检测，发现在重度不典型增生上皮和腺癌标本才有C-myc基因扩增现象，从而认为C-myc基因扩增在食管腺癌的发生、发展过程中是一个晚期事件。国内杨立峰[6]等研究发现，myc基因扩增率高的食道癌患者其淋巴结转移率及外侵性显著高于对照组，以此可以推测，myc基因过度表达的食道癌细胞预示高度恶性、侵袭、转移率高，治疗预后差。
1.2 C-erbB-2基因
C-erbB-2基因定位于17q21，最早在乙基亚硝基脲引起的大鼠神经母细胞癌株中发现，可以编码184kU的具有酪氨酸酶活性的跨膜糖蛋白，后续研究认为其在细胞增殖和分化调控中起重要作用。Lam等[7]研究癌旁不典型增生组织及Barrett粘膜中发现C-erbB-2的基因扩增和过表达，认为这一现象可能是部分食道癌发生中的早期事件，也有研究表明其在食道癌的淋巴结转移过程中发挥作用，提示C-erbB-2蛋白表达阳性者较阴性者更容易发生淋巴结转移[8]，导致预后不佳。
1.3 CyclinD基因
CyclinD基因，又称为prad1基因，位于11q13号染色体上，目前研究认为其是一种细胞周期相关癌基因。CyclinD基因可编码CyclinD1蛋白，后者是细胞周期结构成分，G1～S转换的关键周期蛋白。在食管鳞癌中常发现CyclinD1基因扩增或过表达，并与淋巴结转移、肿瘤分期和生存率下降等相关。Roncalli[9]等研究发现，食道癌组织中存在CyclinD基因的扩增和过度表达，正常食管上皮和胃粘膜组织则无基因扩增和过度表达现象。CyclinD基因与抑癌基因Rb及p16关系密切，有研究认为cyclinD和p16在调节细胞周期活动中构成反馈调节通路[10]，并产生相互拮抗作用，两者任一发生突变或过表达等异常均可引起调节通路障碍而表现为细胞增殖失控，细胞过度增殖并导致癌症的发生。
1.4 MTA1基因
MTA1是新近发现的一个肿瘤浸润转移侯选基因，位于人染色体14q32.3，基因全长为2.2kb，编码一个含703个氨基酸残基的蛋白质mtal，分子量为79.4 kD，属于核小体重构和脱乙酰基复合物（NuRD）的组成成员之一，它通过促进组蛋白脱乙酰基，影响基因的转录和复制，参与信号传导和基因表达调节，与多种肿瘤组织，尤其是上皮源性恶性肿瘤组织的侵袭转移能力密切相关[11]。Toh等[12]对47例食管鳞癌标本进行研究发现，47例样本中有16例发生MTA1基因高表达，且与食道癌发生血管浸润和淋巴结转移呈正相关。王俊平等[13]研究亦发现人食管鳞癌组织MTA1蛋白表达明显升高，MTA1与食道癌的发生发展及浸润转移有关。
1.5 MET基因
MET基因定位于7q31区，其编码产物为一种190 000的酪氨酸激酶受体，是一种肿瘤转化基因。作用机制可能为其编码受体通过与肝细胞因子相结合，进而使酪氨酸激酶磷酸化，启动细胞的有丝分裂，并促进细胞变形和向腺上皮的形态分化。Hu等通过对61例食管鳞状细胞癌样本的研究发现，发现MET的表达率高达91.8%，且与食管鳞癌的分化程度明显相关。秦艳茹等[14]研究发现，MET在食道癌组织中的阳性率高于癌旁正常组织，食道癌转移淋巴结组织中MET的阳性率高于癌组织，提示MET可能与食道癌不良预后和淋巴结转移有关。
2 抑癌基因
2.1 DPC4
DPC4基因是重要的抑癌基因，定位于染色体18q21.1。其编码蛋白Smad 4是转化生长因子（transforming growth factor，TGF）超家族受体的直接底物。在TGF-β信号转导途径中，DPC4与不同的Smad蛋白相互作用是信号转导的中心环节。肿瘤DPC4基因失活，会导致Smad-TGF-β信号转导途径的破坏，从而失去对肿瘤细胞增殖的抑制作用[15]，因此DPC4也可被认为是一种肿瘤抑制剂[16]。
有研究应用免疫组织化学SP法检测了174例食道癌组织和30例癌旁正常食管黏膜的DPC4基因的蛋白表达，研究显示DPC4在癌旁正常食管黏膜和食道癌中的阳性表达率分别为80%、40.8%，二者差异有统计学意义，说明DPC4的低表达与食道癌的发生有一定的关系。研究表明，DPC4的表达缺失与组织分化有关，分化越差的恶性肿瘤，DPC4的缺失率越高[17]。
2.2 PTEN
PTEN又称MMAC1或TEP1，是Li等[18]从原发性乳腺癌、前列腺癌以及胶质母细胞瘤细胞株克隆得到的，定位于人染色体10q23.3，是一种具有双特异性磷酸酶活性的新型抑癌基因，也是目前惟一具有磷酸酶活性的抑癌基因，该基因可通过对PIP3脱磷酸，抑制PIP3/PKB生存信号在细胞内的转导，诱导细胞停滞在G1期或促使细胞凋亡[19]，在肿瘤细胞浸润、肿瘤转移中起到一定作用[20]。而至今在食道癌研究表明，PTEN基因突变在食道癌组织中的发生频率较低，而仅表现为蛋白表达普遍下降[21]。PTEN蛋白在正常食管鳞状上皮和癌组织都主要表达于细胞浆内，胞核内也可见，呈棕黄色颗粒[20]。李劲松等研究显示[22]， PTEN在食管鳞癌中的表达率明显低于癌旁正常食管黏膜组织，差异有统计学意义。Tachibana等[23] 研究发现PTEN的表达随着肿瘤的恶性程度升高有下调的趋势。蒋虹等[24]研究发现，食道癌组织中PTEN表达水平明显低于癌旁组织，呈负相关关系，且随着食道癌的进展，其表达呈逐渐下降趋势[25]。
2.3 DMBT1
DMBT1基因位于人类染色体10q26.13，因在髓母细胞瘤和胶质细胞瘤中广泛缺失而得名，该基因表达产物可促进细胞的分化，发挥其抑制肿瘤发生和转移的作用。研究表明，该基因表达下调、缺失、突变失活与多种肿瘤，特别是与上皮细胞肿瘤的发生发展、淋巴结转移、肿瘤浸润深度存在一定相关性。张光斌[26]等研究发现DMBT1在体外的过表达会抑制食道癌细胞的侵袭，但具体机制目前还不能阐述清楚。王越英等[27]研究报道，在食道癌组织中，DMBT1mRNA阳性表达缺失率存在明显增高，且其缺失率于淋巴结转移和肿瘤外侵严重程度明显相关。
2.4 nm23
nm23由Steeg等在1988年从K-1753鼠黑色素瘤细胞株分离出来，是肿瘤转移抑制基因。该基因在人类定位于染色体17q21-22，全长8.5 kb。陈艳[28]等对哈萨克族食道癌样本的研究中发现，nm23-H1低表达与肿瘤浸润转移高度相关，其可能机制为nm23-H1低表达导致食道癌细胞转移表型，并改变了其生物学行为，进而与肿瘤的浸润及淋巴转移有关。
3 结语
总之，食道癌变是一个多阶段进行性演变过程，其病因学研究涉及遗传和环境多个方面。在其遗传病因学研究方面，众多的研究涉及到多种相关或独立的基因或分子改变，并认为食道癌变是多种基因变化综合作用的结果。但各种分子事件在食道癌肿瘤发生、发展过程中的作用比重及机制，目前尚缺乏权威数据，需要进一步研究。近年来，食道癌的遗传学研究主要集中于寻找并研究癌变早期基因，并进一步深入探讨其致癌机制，以实现食道癌的早期诊断、治疗、高危人群早期检测及生物防治，为降低食道癌的发病率和病死率提供参考或依据。食道癌基因治疗的研究也形成一定的规模，有望在不久的将来实现突破。
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关键词：原子力 显微镜 生物医学 应用
1 原子力显微镜工作原理
原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）是一种以物理学原理为基础，通过扫描探针与样品表面原子相互作用而成像的新型表面分析仪器。它属于继光学显微镜、电子显微镜之后的第三代显微镜。AFM通常利用一个很尖的探针对样品扫描，探针固定在对探针与样品表面作用力极敏感的微悬臂上。悬臂受力偏折会引起由激光源发出的激光束经悬臂反射后发生位移。检测器接受反射光，最后接受信号经过计算机系统采集、处理、形成样品表面形貌图像。早期研制的为接触式原子力显微镜，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光电二极管输出电压的变化构成反馈回路控制压电陶瓷管伸缩，从而调节固定于扫描器上样品的位置，保持样品和探针间作用力（悬臂弯曲度）不变，测量每一点高度的变化。后者保持样品和探针间的距离不变，测量每一点作用力的大小。这种模式在调节探针与样品距离前即可直接观测悬臂弯曲度的改变。除传统的接触式之外，1993年又研制出轻敲式原子力显微镜。该显微镜在扫描过程中探针与样品表面轻轻接触，悬臂受存在于两者间的排斥力作用随样品表面起伏发生高频振颤。由于探针与样品的接触短暂，因此它更适用于质地脆或固定不牢的样品 ［1］ 。
2 原子力显微镜的应用
在AFM诞生最初的一段时间主要应用于电化学、材料科学等领域。近些年，人们逐渐探索着运用AFM对生物样品进行纳米水平的观测及显微操作等。与其它显微镜相比，AFM的纳米量级的高空间分辨率尤为突出，横向分辨率可达0.1～0.2nm，纵向分辨率高达0.01nm。此外，它不但能够对生理状态下的样品成像，而且可以实时动态地研究样品结构和功能的关系。故而，AFM成为纳米尺度上研究物质结构、特性和相互作用的有力手段。以下主要对这项纳米技术在生物医学研究领域中取得了显著的成绩作一综述。
2.1 形态结构 作为新兴的形态结构成像技术，AFM实现了对接近自然生理条件下生物样品的观察。这主要由于它具备以下几个特点:（1）与扫描电镜和透射电镜这些高分辨的观测技术相比，样品制备过程简便，可以不需染色、包埋、电镀、电子束的照射等处理过程;（2）除对大气中干燥固定后样品的观察外，还能对液体中样品成像;（3）可以根据观察者的要求，调节样品所处的温度、湿度、大气、真空等观察条件。目前，AFM已广泛地应用于细胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子结构的研究中。对一个细胞而言，AFM不但能够提供长度、宽度、高度等形态方面的信息，还可以满足人们对膜上的离子通道、丝状伪足、细胞间连接等细微结构的研究 ［2，3］ ，甚至还可清楚地观察到膜身的骨架结构 ［4］ 。后者对细胞表面与表面下结构相互作用的进一步研究非常有利。Qian ［5］ 等利用AFM对酵母的热休克蛋白Sis1与Ssa1进行观察，发现只有Ssa1的lid区一端与Sis1缩氨酸结合区作用，并且Sis1二聚体的缩氨酸结合区呈现较高水平的凹槽结构，这有助于阐明蛋白相互作用机制及其在蛋白折叠、组装、降解、转移中的重要作用。定的生理生化反应会引起生物样品空间结构的变化。利用AFM对这些变化的观察，为细胞结构及结构调节的生理意义等研究提供更多有价值的信息。例如Liu ［6］ 等将大麦的中期染色体经严格点干燥、2M NaCl处理后提取出2种非组蛋白。通过AFM在纳米水平显示提取蛋白后染色体的三维结构，发现处理后的染色体发生下列变化:高度降低同时表面较前粗糙。又如:Sit ［7］ 将纤维蛋白原固定在3种不同基底表面，研究样品发生的结构变化。由AFM的三维定量分析显示纤维蛋白原按照mica
2.2 力学特性 由于利用AFM可对扫描各点高度及作用力的测量，这就意味着我们不仅可以获取生物样品的表面形态和三维结构，还可以得到其表面硬度、粘弹性、摩擦力等力学特性的表面图谱 ［10］ 。例如AFM在扫描样品时，探针尖端作用样品可使样品产生可测量的凹陷。当应力与应变力成线性关系时，样品发生的变形属弹性变化，即撤销力时样品可恢复原有形态。我们利用凹陷的深度数据就能够获取有关样品局部的弹性信息。Alcaraz ［11］ 等利用AFM测量支气管上皮和肺泡上皮细胞在不同负荷力和作用频率下的复剪切弹性系数，观察其变化规律。在样品表面性能测量中，应该考虑到探针可能同时会受到其他作用而影响实验数据。在该实验中作者就针对溶液粘性牵拉力及与样品接触的探针几何形状引起的偏差予以校正，使测量结果更准确。
2.3 分子间力 将很高的空间分辨率与敏感且准确的力学感应性相结合，是AFM的一个极为显著的特点。通过将探针连接在弹性系数很小的悬臂上，AFM对力的测量敏感性可达到pn水平。到目前为止，AFM已经广泛地运用于测量溶液中生物分子间相互作用如与生物反应有关的水合力的研究 ［12］ 。利用这些研究结果还有助于对生物分子结构和机械性能进行分析。例如，蛋白质依靠多种非共价作用而保持其结构稳定，通过机械或化学的方法将蛋白伸展后，可以利用AFM直接测量稳定蛋白结构的作用力，并进一步探究这些力对蛋白结构的影响。近几年AFM对肌蛋白titin的去折叠研究取得的显著成果即有力地说明了这一点 ［13］另外，AFM还能够测量单个分子间微弱的非共价力。例如测量受体-配体的去结合力，若受体固定在基底表面的话，则将与之对应的配体固定于探针表面，使探针功能化。随探针-样品的距离逐渐缩小，悬臂受探体-样品间吸引或排斥力的作用向接近或远离样品的方向偏折，悬臂偏折的最大幅度反映分离紧密结合两分子所需的力。在测量中，有可能会受到探针与表面的非特异性相互作用的干扰 ［14］ 。因此，有必要认真地选择对照实验包括使用未功能化探针;或基底所处的溶液中利用游离的配体封闭受体;调节溶液的离子强度或pH，降低静电力的干预 ［15］ 。除此之外，探针还有可能受溶液粘性牵拉力作用，使撤离速率减慢至记录数据低于实际的作用力。
2.4 显微操作 通过在纳米级水平调控探针的位置和施加力，AFM可以实现对生物分子进行物理操作如切割生物结构，转移分子至特定位置。在一定的范围调整施加力，AFM在成像的同时即可对样品进行操作。施加力的范围主要由悬臂的力学常数和探针粗细决定。与标准显维切割技术相比，AFM对目标区域切割、提取等操作具有更准确的特点。1992年Hansma ［16］ 利用AFM切割遗传物质DNA分子的特定位置，这是人们首次使用AFM对生物分子进行的可控性纳米操纵。随后它在生物膜的切割 ［17］ 、待研究分子的分离 ［18］ 等方面也得到广泛的应用。
3 AFM在染色体研究方面的进展
AFM的高分辨成像和简便的样品制备过程吸引了众 多学者利用它对染色体结构进行研究。但早期由于镶嵌于30nm蛋白质层的RNA吸附在染色体的表面 ［19］ ，同时盐、细胞残渣等随同染色体滴片时吸附于玻片上 ［20］ ，妨碍染色体表面更细微的结构成像。近来随着染色体制备方法的改善和AFM成像技术的提高，该方面的研究得到进一步的发展。染色体经胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中观察，不仅去除了表面的蛋白质层，而且再次水化后染色体体积增大5～7倍，能够分辨出样品表面的染色质纤维所形成的环状结构 ［19］ 。最近利用该方法使染色体成像横向和纵向分辨率分别可达到1nm、0.1nm，并且发现染色质纤维是由放射状排列染色质环与盘绕的螺旋管状结构共同组成 ［21］ 。在G、C分带中期染色体的三维结构观察 ［7］ ，染色单体型畸变识别 ［8］ ，核型分析等方面研究的应用证实了与光学显微镜、扫描及透射电镜等成像工具相比AFM具备独特的优势:它不仅能够识别染色体畸变，同时可以对结构变化进行细微的观察。除正常染色体的结构及表面性质的研究，AFM还对G分带染色体形态发生的一系列变化进行观察。研究发现随胰蛋白酶作用时间的延长，染色体除周边之外的其余结构将逐渐发生崩解 ［22］ 。中期染色体经G、C分带会出现纵向高度的差异 ［23，24］ ，各条带中染色质纤维排列的松紧度也有所不同 ［25］ 。这些都有助于染色体分带机制的阐明。对重离子射线诱发染色体畸变分析发现AFM不但识别出染色单体裂隙和单体断裂，还清楚观察到单体型畸变的断裂点纤维状结构 ［26］ 。这证实了AFM是辐射诱发染色体畸变的结构研究中十分有用的工具。可见，AFM已在染色体结构、物理性质等方面研究获得很大的进展。另外，作为一种纳米操纵工具，AFM还被用于纳米切割染色体，提取DNA制作FISH实验的探针等 ［27］ 。
在亚细胞水平结构研究的基础上，发挥AFM连接亚细胞结构、分子水平研究的桥梁作用，它有可能在基因定位和功能研究等方面得到进一步的应用与发展。综上，凭借它对染色体纳米量极的成像和显微操纵，AFM有希望成为结合细胞遗传学和分子遗传学的有力工具。
4 展望
1986年，AFM作为一种新的成像技术被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的纳米水平单分子成像，逐渐扩展到表面功能的研究，分子间力的测量，可控性分子操作等多个领域。当然，不容忽视，在上述的AFM多种应用中仍存在一些有待进一步完善、解决的问题，也就是说，作为一个新兴的研究工具，它同样也存在着自身的不足。除了在实验中不断地分析、探求更好的解决方法之外，我们更应该将AFM与其他成像工具相结合，取长补短，以便能够更大程度地挖掘其内在潜力，使AFM在生物医学研究中做出更大的贡献。相信随着这项多功能技术的相关工作的不断发展，它会为形态结构、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新发现。 参考文献
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