发布时间：2023-07-19 17:12:01
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的基因治疗的基本策略样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
1基因治疗的途径和常用载体
基因治疗技术，一种新的治疗策略在口腔再生医学领域中的应用发展迅速。基因治疗通常采用两种途径，体外间接基因治疗(ex vivo)和体内直接基因治疗(in vivo) [3,6]。无论间接还是直接基因转移都需要借助载体才能将外源基因转入靶细胞内。目前载体系统主要分为病毒和非病毒两种[3]，常用的病毒载体有腺病毒（AV），腺相关病毒（AAV），逆转录病毒（RV，包括慢病毒载体），单纯疱疹病毒（HSV），杂合病毒等[7-9]。非病毒性载体有裸DNA、脂质体与脂质体复合物、纳米颗粒等[3]。
2基因治疗在口腔再生医学中的应用
2.1 颌面骨组织再生：用于治疗颌骨缺损的靶基因很多，作用机制和环节不尽相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]应用脂质体和腺病毒载体分别将BMP-2基因导入大鼠骨髓基质细胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比较了两种载体的体外、体内成骨能力。体外实验结果显示腺病毒组的转染效率是脂质体组的两倍。当将基因修饰细胞复合明胶海绵植入大鼠下颌骨的骨缺损区，BMP-2可以在体内表达2 周以上，促进了下颌骨骨缺损的修复，其中腺病毒组4周后骨缺损几乎完全愈合，而脂质体组相对新骨形成速度较慢，6周后骨缺损基本愈合，阴性对照组8周时仍未见骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介导的BMP-2转染BMSC细胞，结合磷酸三钙支架材料可以修复下颌骨的缺损，获得矿化密度较高的新生骨。Chang等[12]应用腺病毒载体携带BMP-2，体外修饰BMSC，并植入小型猪的上颌骨缺损区，实验组的骨缺损在3个月后完全修复，组织学观察显示新生骨为成熟的编织骨且钙化良好。近期，Ke等[8]应用安全性较好的AAV病毒载体介导BMP-2体外修饰BMSC，并将其植入兔子的上颌骨缺损，颌骨缺损的修复能力显著提高。Ashinoff等[13]研究通过腺病毒介导的BMP-2 对大鼠下颌骨牵张成骨的影响。实验结果表明，实验组在牵张成骨部位新骨形成量显著增加。
BMP基因治疗在促进颌骨组织再生中的应用非常广泛，近来也有一些研究报道了其他治疗基因的应用，例如碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]将腺病毒介导的bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞移植入兔子下颌骨牵张成骨区域，可以有效地促进更多的新骨形成。Edward等[15]将逆转录病毒介导的Shh修饰的三种细胞(牙龈纤维细胞、间充质干细胞、脂肪来源细胞)复合I型胶原植入兔的颅骨缺损处，6周后通过X线片、组织学观察，骨组织缺损区域几乎完全修复，同时机体没有出现任何不良反应。
颌骨的生长调控需要多因子的协同作用，多个治疗基因的联合应用也取得了一定进展。Koh等[16]的研究证实通过基因治疗的同时表达两种成骨因子BMP2和BMP7，表现出了更强的骨组织再生能力。通过X线片，Micro CT和组织学切片进行检测，4周后 BMP2和BMP7的联合基因转染组，其成骨能力显著高于单个基因转染组，表现为颅骨缺损区域几乎完全修复，甚至个别缺损区的成骨量更致密，显著高于阴性对照组。另外，将促血管生成因子与成骨因子联合应用，可以更好地协同促进颌骨组织再生。Peng等[17]的研究表明单独应用VEGF并不能促进骨的再生，但是将VEGF和BMP4基因共同修饰MDSC，并与明胶海绵共同植入小鼠的颅骨缺损区域后，血管新生和新骨形成能力显著增强。
2.2 颞下颌关节组织再生：颞下颌关节的组织工程需要促进功能性骨和软骨组织再生，并需要建立适当的骨-软骨交界区。 Schek等[18-19]将分化的猪软骨细胞和Ad.BMP7基因修饰的人牙龈纤维细胞复合到生物支架中，并将复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后构建了一种骨-软骨组织，包括血管化骨，成熟的软骨以及清晰的矿化界面。另一项研究进展是将基因直接导入下颌髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒载体携带B-半乳糖苷酶基因直接体内法注射到豚鼠颞下颌关节上腔，4周后发现，关节软骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的稳定表达，从而证明了腺病毒介导基因治疗颞下颌关节疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒载体介导了治疗基因VEGF感染了大鼠的髁突组织，体内试验证明VEGF的表达增强，促进了下颌髁突的软骨内成骨进程。Li等[22]用AAV病毒载体携带Vastatin基因，局部注射到颞下颌关节后区，进一步证明转基因不仅表达在髁突软骨，而且在关节盘和关节窝都有持续的表达。这些研究为生理性骨-软骨结构的构建以及TMJ局部基因治疗的应用前景提供了实验依据。
2.3 牙周组织再生：牙周病造成牙周支持组织破坏及牙周附着丧失，是导致牙齿缺失的最主要原因。牙周病治疗的目的不仅在于控制炎症，更在于使已经破坏的牙周组织再生以形成新附着。牙周组织再生包括因炎症破坏吸收的硬组织(牙槽骨与牙骨质)和软组织(牙周膜与牙龈)。Jin等[23]将携带血小板衍生生长因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺损处，结果显示，病毒感染组牙槽骨的修复4倍于对照组，而牙骨质的修复则6倍于对照组，提示应用PDGF- B 基因治疗可以促进牙周的修复潜能。Chang等[24]的进一步研究证实在牙周骨缺损处直接局部注射腺病毒介导的PDGF-B 是安全可靠的，没有发现治疗引起的机体不良反应。尽管2周内在缺损局部可以检测到病毒载体的DNA, 随着时间的推移病毒载体的量逐渐衰减。可见PDGF-B基因转染可有效地促进细胞增殖和缺损的充填，证实了基因转入牙周细胞可以为牙周再生提供一个便捷的途径。
2.4 牙体组织再生：牙再生的研究是口腔再生医学研究中最为活跃的领域。Rutherford等[25]采用了体外间接基因转染方式，将携带BMP-7的腺病毒载体感染培养的成体纤维细胞，然后将修饰后的细胞与胶原复合植入白鼬炎性牙髓组织中，研究发现BMP-7的基因转染促进了修复性牙本质的形成。Nakashima等[26-27]用电穿孔（Electroporation）的方法将分化因子（Gdf1）转染到培养的小鼠牙髓细胞中可以在体外促进其向成牙本质细胞转化。Nakashima等[28]又用超声波的方法转染Gdf1，发现它还可以促进犬的自体牙髓干细胞分化为成牙本质细胞，同时在犬的模型上修复性牙本质的形成增加，其中管状牙本质的再生最为明显。可见，通过转染特异性基因和生长因子进入成体牙细胞，为促进组织工程牙的形态发生提供了新的思路。
3基因治疗的前景展望
成功的基因治疗必须包括选择适当的治疗基因、适当的转导，使其在体内获得安全、持续和可调控的表达。口腔再生医学领域的基因治疗，虽然在动物试验上取得了一些初步经验，但是离真正的临床推广应用还有相当长的一段距离。将来的研究将着眼于以下几个方面：①对于目的基因，仍需进一步明确何种基因或多种基因的联合应用；②选择与构建一个安全、高效、可调控的甚至是具有组织特异性的靶向基因载体仍是基因治疗面临的重要问题；③在基因转导方法上仍需决定最佳基因载体或者靶细胞的数量、最佳转入体内的时机，以及减少不良反应以达到最佳治疗效果。随着现代分子生物技术日趋成熟和基因工程研究的深入，相信这些问题在不远的将来都会得到解决。
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RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由内源性或外源性双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）所诱发，高度特异性降解细胞内同源mRNA，使基因沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，故又称为转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）［1］。RNAi是生物体在进化过程中抵御病毒入侵，抑制由转座子移动或重复序列的积累引起的基因组不稳定的保护机制，另外还是基因表达调控的一条重要途径。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）是指干涉RNAi过程中在细胞内产生的长约21～23核苷酸（nt）的小双链RNA分子，是RNAi发挥功能的重要中间效能分子。RNAi自从1998年发现以来，就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地，迄今已成为基因研究中不可或缺的工具之一，并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟，已开始应用于疾病防治等多个方面。本文就其机制，主要特征，以及在消化系肿瘤中的研究作一简单综述。
1 作用机制及主要特征
1.1 作用机制
RNAi在哺乳动物细胞中有两种作用机制：一种是大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）产生的广泛的、非特异性效应。其机制可能是激活了细胞内的蛋白激酶R和RNA酶L，从而导致了非特异性的细胞凋亡。另一种是21～23 nt的短双链RNA（siRNA）产生的相对具体的、特异性效应。目前，RNAi在抗病毒及肿瘤中的研究主要集中在siRNA产生的特异性效应，故下面主要介绍siRNA的作用机制。
siRNA的作用机制目前尚未完全阐明，但已基本达成共识，即①dsRNA在细胞内与DICER酶（一种RNAaseIII家族异性识别dsRNA的酶）结合，随即被分割成21～23个核苷酸的短链dsRNA，在这个过程中需要ATP的参与。②分割下来的短链dsRNA即为siRNA，它是RNAi的起始诱导物，与DICER酶形成RNA引导的沉默复合体（RISC），此时RISC无活性，随后，siRNA经历一个依赖ATP的解双链过程激活RISC［2］。③siRNA特异性地识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，RISC中的DICER酶将mRNA切割成21～23个核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，导致不能进行翻译过程，从而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表达。④新产生的dsRNA（siRNA）可继续形成RISC复合物进入新一轮RNAi的循环，产生正反馈效应。这一过程需在RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的条件下进行。除上述机制外，转基因真核生物dsRNA 还可引起相应基因的甲基化，促使异常RNA产生，最终导致基因沉默［3，4］。
1.2 主要特征
1.2.1 高度特异性 RNAi严格遵循碱基配对原则，只降解与之同源的基因的RNA，达到阻止基因表达的目的。
1.2.2 高效性 相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，在哺乳动物中虽没发现扩增效应，但在细胞实验中只需摩尔级浓度的 siRNA 即可有效抑制目标基因的表达。
1.2.3 可传递性和可遗传性 RNAi抑制基因表达的效应可跨越细胞的界限，甚至可以传播至整个有机体及子代细胞。
1.2.4 浓度、时间双重依赖性 在一定时间内RNAi的效应强度随siRNA的浓度增高而增强，或浓度一定的情况下，随着时间延长，siRNA在细胞内发生正反馈效应，导致浓度增高，使RNAi效应增强。
1.2.5 ATP依赖性 目前研究发现RNAi中至少有2个步骤消耗ATP［5］：DICER酶切割dsRNA成为siRNA并使其5′端磷酸化或胞内磷酸化酶使导入的siRNA 5′端磷酸化而使其成为有活性的siRNA的过程；RISC活化即siRNA解双链的过程。
2 RNAi在消化系肿瘤治疗中的应用
肿瘤的发生、发展与原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的异常表达等均有密切的关系。因此我们可以针对这些因素，利用RNAi相关技术在不影响正常基因功能的条件下抑制突变基因表达或基因的表达过量，从而达到基因治疗的目的。另外，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，当单一癌基因的阻断不能完全抑制或逆转时，可以设计一种针对同一家族多个基因的保守序列的siRNA分子，便可以同时抑制这一家族的多个基因表达，且抑制效果互不干扰。
2.1 原癌基因
原癌基因是细胞基因组内正常的组成成分，自然状态下无致癌作用，其主要作用是通过编码生长因子等调节正常细胞的生长、分化。原癌基因激活是肿瘤发生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成为目前研究肿瘤治疗的热点之一。
2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人类肿瘤中呈活化状态最普遍的原癌基因，有数据显示此基因的突变现象存在于30%～50%的肿瘤组织中，在胰腺癌中可高达85%。Brummelkamp等［6］建立了突变体的表达系统即pSUPERKrasv12，转染人胰腺癌CAPAN1细胞系后，观察到pSUPERKrasv12能显著降低Krasv12的mRNA表达水平。构建突变体Krasv12的siRNA病毒载体转染CAPAN1细胞亦能抑制细胞克隆生长，并阻止裸鼠肿瘤的形成；而对照组细胞生长良好并产生克隆，体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤，因此证明了该siRNA具有明显的特异性和抑制肿瘤生长的作用。 同时，他们采用反转录病毒载体RNA系统在体外也成功地抑制了ras基因的表达。
2.1.2 Fos基因 Fos基因是一个重要的促进肿瘤细胞转移的基因，其产物Fos蛋白与肿瘤细胞的运动有关。Fra1蛋白是Fos蛋白家族的成员之一，主要在大肠癌Hct116细胞株和BE细胞株中表达。用siRNA 转染fosL基因，然后再转染到BE细胞中，发现Fra1蛋白对细胞的增殖没什么影响，却极大地降低了BE细胞的运动能力，大约降低为原来的1/10［7］。
2.2 抑癌基因
由于抑癌基因在细胞增殖调控中起重要作用，因此也成为基因治疗的重要目标之一。p53基因是最早利用RNAi技术研究的基因之一，人体内大约50%肿瘤的发生是p53基因突变的结果。p53基因能够抑制DNA合成及诱导DNA修复来抑制细胞生长，使细胞停滞在G1期。突变型p53失去对细胞增殖的负调控作用，导致细胞增殖失控发生癌变。Martinez等［8］的报道中，将H1299细胞转染野生型p53和突变型p53的RNA表达型质粒，结果，野生型siRNA明显抑制野生型p53蛋白的表达，对突变型几乎无效；而突变型siRNA显著抑制突变型p53蛋白表达，野生型基因则不受影响。由此证明，RNA序列能特异性地分别抑制这两个基因的表达，并且对突变型p53的抑制可在一定程度上恢复野生型基因的表达和功能。这就为选择性和个体化治疗肿瘤提供了可能。
2.3 细胞凋亡相关基因
细胞增殖和凋亡之间的动态平衡对于机体的生长发育有着举足轻重的影响。凋亡过程的失调可能导致肿瘤的发生。有研究表明［9］，将表达有绿色荧光蛋白(GFP)的BclXLsiRNA转染人胃癌细胞株MGC803，用RTPCR和免疫荧光法检测BclXL的表达，48 h后发现，与siRNA阴性组相比，实验组GFP明显减少，BclXL蛋白和BclXL mRNA表达减少到基准水平以下，并有自发的细胞凋亡现象，凋亡率达21.17%。这就说明BclXL特异性siRNA能够抑制凋亡抑制基因BclXL的表达，从而诱导胃癌细胞株MGC803凋亡。
2.4 其他相关基因
2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等肿瘤的发病中起到重要作用，尤其见于弥散型胃癌。有研究表明将核仁蛋白NoL8特异性siRNA转染3种弥漫型胃癌细胞ST4，MKN45，TMK1，可以有效地降低该基因的表达，并能诱导这些细胞发生凋亡。因此，可以考虑把Her2作为胃癌基因治疗的又一新的靶点［10］。
2.4.2 β连环蛋白和APC基因 β连环蛋白和APC基因是WNT信号传导途径的关键成分。这些基因的突变可引起β连环蛋白表达水平增加，导致细胞过度增生，促进结肠息肉和结肠癌的发生。Verma等［11］构建了β连环蛋白的多个靶区域，使得蛋白表达量降低90%。有学者进一步用转染β连环蛋白siRNA 的结肠癌HCT116细胞注射裸鼠，发现有50%的老鼠存活超过70 d，而对照组则全部死亡。
2.4.3 血管内皮细胞生长因子（VEGF） VEGF是体内一种重要的促血管生成因子，在恶性肿瘤的发生、发展及预后过程中均有着极其重要的作用。Zhang等［12］设计了针对鼠VEGF各亚型的siRNA，以DNA为模板在细胞内诱导小片段双链RNA的形成，干扰结果均特异性抑制相应VEGF的表达。同时，Takei等［13］设计了针对人VEGF的siRNA，采用体外合成法得到相应的siRNA，将其注入到荷瘤鼠模型的肿块中。结果肿瘤组织中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明显低于对照组，肿瘤体积亦明显小于对照组。徐文华等［14］设计两组针对VEGFmRNA 的siRNA，用脂质体转染人胃腺癌细胞系SGC7901，观察其细胞周期的变化。发现G0/G1期细胞增多， S期细胞减少，细胞周期阻滞于G0/G1期;并能诱导细胞凋亡产生凋亡小体。这些结果无疑将给肿瘤的基因治疗提供了新的思考方向。
2.4.4 TGFβ1 TGFβ1是一种多功能生长调节因子，与多种肿瘤的转移关系密切。它可使胃癌细胞表达的黏附分子如CD44表达增多；抑制腹腔内淋巴细胞活性使其无法有效杀伤腹腔内游离癌细胞以及血管生成，同时可使间皮细胞变形，腹膜纤维化等。吴涛等［15］利用载体介导的RNAi技术干扰TGFβ1，发现TGFβ1蛋白在人胃癌细胞株SGC7901中下降约65.8%，腹膜间皮细胞TGFβ1蛋白下降约61.8%。这一结果有力证明了siRNA能抑制TFBβ1在人胃癌细胞株SGC7901和腹膜间皮细胞中的表达，为今后胃癌腹膜转移靶向治疗奠定了坚实的基础。
2.4.5 埃兹蛋白(Ezrin) Ezrin作为ERM （ezrin radixin moesin)蛋白家族的成员，是一种细胞膜与细胞骨架的连接蛋白，其主要功能是参与细胞的生长和信号转导，接受胞外信号，使骨架蛋白重新排布，并增加细胞运动能力。近来发现， Ezrin的表达与大多数肿瘤转移相关，如Ezrin表达水平与黑素瘤的分级［16］和乳腺癌的发生转移［17］均呈正相关。颜歌等［18］采用小干扰RNA 方法抑制肠癌细胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表达，发现Ezrin mRNA和蛋白表达水平均显著下调，肿瘤细胞的运动侵袭能力下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少。这预示Ezrin蛋白有可能成为抑制肠癌发展、转移的新靶点。
2.4.6 多药耐药（multidrugresistance，MDR） MDR一直是肿瘤治疗的棘手问题之一。研究证实抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相关， Guo等［19］应用siRNA敲除Runx3基因后发现癌细胞对多种化疗药物耐药，将携带Runx3的真核生物表达载体转染人类胃癌耐药细胞系SGC7901，体外药敏性分析显示SGC7901 对各种化疗药物敏感。进一步分析显示Runx3可以抑制MDR1和MDR相关蛋白1 (MRP1)启动子的活性， Runx3的高表达可能通过下调MDR1，MRP1，Bcl2的表达，进而使胃癌细胞对化疗敏感。另外，其中的MDR1基因的过度表达及其基因产物P糖蛋白增加是导致MDR的重要原因之一，Nieth等［20］设计了特异的siRNA分别处理胰腺癌EPG85257RDB细胞和胃癌EPG85181RDB细胞来抑制MDR1的表达。结果发现这两种细胞的MDR1的mRNA和蛋白表达量可降低90%以上，癌细胞对柔红霉素的耐药作用分别降低了89%和58%。这也提示我们，siRNA介导RNAi技术为克服肿瘤耐药问题可能提供新的策略。
2.4.7 保罗样激酶1（Pololike kinase 1， Plk1） Plk1是丝氨酸-苏氨酸激酶之一，参与了有丝分裂的不同阶段。Jang等［21］检测发现280例胃癌患者中Plk1表达率高达95％（268/280），用RNAi的方法阻断Plk1表达后，癌细胞的生长明显受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，细胞周期调节蛋白B的表达增加，胃癌细胞堆积于G2/M期，有丝分裂纺锤体形态异常，染色体分离延迟，胞质分裂延迟或者停止，增殖减慢［22，23］。另外，Plk1基因的缺失亦伴随癌细胞凋亡的增加，提示Plk1可能成为胃癌基因治疗的理想靶点。
3 问题与展望
RNAi这一方兴未艾的新技术，为肿瘤及其他疾病的基因治疗提供了新的途径。但是仍有许多问题亟待解决：①如何在体内实现靶基因RNA转移到所有肿瘤细胞并稳定持久地抑制癌基因表达；②如何确定21～23 nt左右的核甘酸序列作为siRNA模板的选择原则；③如何提高载体系统的效率等等。总之，RNAi技术作为一种研究的新工具，治疗的新手段，随着对其机制的不断认识和技术的改进，必将在消化系肿瘤的研究及治疗中担任不可替代的角色，同时也预示着后基因组时代里一个崭新的RNA时代的到来。
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1 ts、ts基因多态性和肿瘤基因组不稳定性
1.1 ts
ts是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白，相对分子质量为72kda,是dna 合成的关键酶， 它催化脱氧尿苷酸（dump） 甲基化， 使之转变为脱氧胸苷酸（dtmp） 。ts 在dna合成与修复、细胞增殖与分化中有十分重要的作用,是肿瘤化疗药5fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。
1.2 ts基因多态性
ts基因位于第18号染色体上(18p11.32),长16kb,主要转录起始位点位于atg起始密码子上游160～180bp，增强子位于起始密码子atg上游约400bp。基因多态性是指在正常人群中同一基因位点上存在两种或两种以上等位基因，且各等位基因皆具有相当高的频率(频率大于 1%)。现已发现，ts 基因非翻译区(untranslated region,utr )中存在多态性。多态性可以分为两类，即长度多态性 (length polymorphism) 和位点多态性(site polymorphism)。
1.2.1 ts基因长度多态性 长度多态性可分为两类：一类为串联重复序列数目不同（variable number of tandem repeats,vntrs），如小卫星；另一类长度多态性是基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星。
(1)5′utr串联重复序列不同数目 启动子是转录过程起始决定部位,对基因表达具有不可缺少调控作用。增强子是增强启动子转录活性的dna序列。ts增强子区存在28bp串联重复序列多态性，根据vntrs，分为含有重复2次的为2r、重复3次的为3r，见图1。
更多重复次数等位基因(4r,5r,9r)出现频率很少。因此,常见的三种基因型为3r/3r、2r/3r、2r/2r。
(2)ts基因3′utr 多态性 2000年，ulrich发现ts mrna 3′utr的1494bp处存在一个 6 个碱基缺失/插入多态,形成+6bp/+6bp、+6bp/-6bp、-6bp/-6bp基因型。ulrich通过95名美国白人检测ts 3′utr基因型分布，可能由于6bp等位基因频率分布很低而将-6bp等位基因称为变异型等位基因。而事实上英国白人、中国人等不少种族-6bp等位基因型占优势。因此我们认为将-6bp等位基因称作变异型等位基因是不确切的［2］。
1.2.2 ts基因位点多态性 基因位点多态性是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变、单个碱基的置换(又称单核苷酸多态性,snp)、缺失和插入。mandola发现在5′utr 2r等位基因第一次重复序列和3r等位基因前两次重复序列中均出现usf家族ebox(cacttg)。3r等位基因第二次重复序列第12个核苷酸等处存在gc snp，见图1 ［1］。因而2r、 3r分别存在2g、2c和3g、3c等位基因型。2r/2r、2r/3g、2r/3c、3g/3g、3g/3c、3c/3c是6 种常见的基因型。snp是人类基因组中最广泛的多态性现象，是造成个体差异的主要的遗传原因,在目前人类基因组研究中倍受关注。
1.2.3 ts基因多态分布频率存在种族差异 不同种族人群中ts基因多态分布频率有很大差别。（1）2r,3r等位基因分布频率在土耳其人中为42%
图1 ts基因5′utr串联重复序列多态性和单核苷酸多态性［1］
fig 1 the ts gene has a variable number of tandem repeats and single nucleotide polymorphism in the 5'untranslated region
和58%［ 3］，在中国人中分别为18.82%和81.00%，而在非洲人中相同。（2）美国白人ts 3′utr+6bp等位基因分布频率为71%,中国人华北、华南地区人群分别为32%和30.9%［4］。基因多态分布频率存在种族差异,显示了遗传背景的多样性和复杂性,可能是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现，对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。
1.3 肿瘤的基因组不稳定性
许多肿瘤还以基因组不稳定、等位基因不平衡为特征。杂合缺失（loh）是等位基因不平衡的常见形式。loh是指来自父方或母方的一个等位基因的缺失。抑癌基因失活通常是在一个等位基因发生突变后，另一等位基因又发生loh。kawakami［5］等通过151例直结肠癌检测5′utr重复序列基因型，50例杂合子中有31例发现2r、3r等位基因的不平衡,即出现loh。杂合性缺失(loh ) 与微卫星不稳定性(msi)是基因组不稳定性的两个主要表型特征。抑癌基因缺失是许多肿瘤形成的关键步骤之一；复制错误也是不少肿瘤发生过程重要环节，能增加抑癌基因的突变。因而肿瘤组织ts基因分型，还要考虑基因组不稳定性等因素。
1.4 ts基因多态性与ts表达水平的关系
ts基因多态性影响了 ts 基因 mrna 的稳定和翻译效率,导致不同基因型 ts表达效率不同。因此，ts基因多态性是ts表达水平高低及其可能存在亚型的主要影响因素。morganti等［6］通过48例结直肠癌患者研究显示3r/3r基因型的癌组织ts mrna表达水平显著高于2r/2r、 2r/3r基因型。mandola等对结直肠癌患者研究显示ts3’tur6bp缺失与在体外降低了的tsmrna稳定性相关，与在体内瘤内较低ts表达相关，可能会提高癌症患风险；这与+6bp等位基因患乳腺癌风险率低的观点一致［4］。
但也有部分学者认为，ts基因多态性与ts表达水平并不存在相关性。2001年kawakami［7］发现ts基因5′utr多态性与ts mrna的表达水平无关。
2 ts、ts基因多态性与肿瘤关系
2.1 ts基因多态性与肿瘤易感性
2.1.1 ts基因多态性与肿瘤易感性 人群中存在易感个体是由于一些与肿瘤发生相关的基因存在多态性。因此,不少学者认为，ts 基因多态性与患癌症危险性密切相关。adleff等［8］报道3r等位基因与患结直肠癌风险升高相关，这可能是3r等位基因导致ts表达水平升高，促进细胞过度增殖、逃避衰老和凋亡的缘故。
2.1.2 ts基因多态性与肿瘤易感因素之间的相互作用 肿瘤的发生、发展受遗传与环境因素共同作用的多因子疾病,基因基因、基因环境交互作用在发病中具有重要影响。(1) 基因基因交互作用。zhengdong zhang等研究显示:tser 2r和 ts3'utr 6 bp等位基因在中国南方胃癌病因学中可能起到协同作用［9］，存在正交互作用。(2) 基因环境的交互作用。高长明［2］发现，ts6bp／-6bp基因型与吸烟、饮酒、和不饮茶的生活习惯在增加胃癌发生的危险性中有明显的协同作用。（3）叶酸水平影响。人类红细胞叶酸水平<140ng/ml或血浆叶酸水平<3ng/ml会诱发染色体损伤，增加患癌风险。ts5’utr 2r等位基因携带者，低叶酸摄入患结直肠癌风险显著升高,两者之间存在交互作用［10］。根据ts基因多态性与肿瘤易感性相关性，可以在症状出现以前作出基因诊断，对肿瘤的预测、预防、早期诊断等具有不可估量的价值。
2.2 ts与肿瘤化疗
ts表达的调节依赖于细胞周期和细胞增殖状态。在同步细胞中，当细胞从g0期进入到s期，ts活性水平增加约20倍。5fu是通过抑制ts而发挥其抗癌活性的。5fu进入体内后,转化为5氟尿嘧啶脱氧核苷(fdump),在辅因子5,10亚甲基四氢叶酸(ch2fh4)的存在下,能和ts结合形成等价的三连复合物tsfdumpch2fh4,影响ts与dump的结合,抑制了dtmp的合成,使dna合成受限,达到消灭癌细胞目的。最近zou k ［11］等用食管癌细胞株和结肠癌细胞株研究报道,胰岛素能通过提高s期细胞数量、改变三连复合物水平而增强5fu的抗癌作用。
不少学者认为，ts水平与化疗疗效间存在负相关。banerjee等［12］报道以ts crna转染肿瘤细胞，使ts高表达，细胞出现对5fu 和fdurd耐药。以ts反义rna转染dld1细胞，ts表达和活力受到明显抑制，对5fu敏感性显著增强［13］。ts基因表达水平在4.0×10-3以上的患者对化疗通常均不敏感。以上研究表明,ts水平可预测肿瘤化疗疗效。
但也有不少学者不同意这种观点。derenzini等［14］认为化疗很大程度上受到肿瘤细胞动力的影响：对生长迅速的肿瘤效果更好。靶酶ts高表达肿瘤以5fu为主基础的化疗改善预后更好。关于ts与耐药之间的关系,尽管各自结论有所不同,两者之间相关性还是得到了大多数科学家的认同。部分学者通过ts表达水平与患者改善预后并不具备统计学差异而得出否定结论,忽视了疗效预后受多因素影响的,所以不足以否定ts水平与化疗疗效间相关性。
在使用ts抑制剂化疗时，肿瘤细胞可出现ts蛋白表达增强，称为ts诱导。ts诱导会导致ts蛋白表达过度、催化活性升高，而导致肿瘤细胞耐药。新型ts抑制剂洛拉曲克在ⅱ期临床实验中证实其对多种肿瘤具有很好的治疗效果，但在短期运用后会诱导ts表达上调而导致肿瘤细胞对其耐药。李亦蕾［15］等研究认为,降低ts诱导即可降低肿瘤细胞耐药性。
2.3 ts基因多态性与肿瘤化疗
遗传药理研究发现，患者对药物的敏感性很大程度上取决于病人的遗传结构组成。基因多态性可引起不同个体在给药时的药理学及毒理学产生不同效果，从而引起药物治疗效果的差异。ts 基因 mrna 的稳定和翻译效率存在差异,并可导致不同 ts 基因型肿瘤患者对5fu为基础的化疗疗效不同。因此多数学者认为ts基因型可作为肿瘤治疗疗效的预测指标。yawata等［16］药敏研究显示：2r/2r和2r/3r组细胞系比3r/3r组对fudr敏感性更高；2r/2r 、2r/3rc、3rc /3rc组（低ts表达组）细胞系对fudr敏感性比3rg/3rg组（高ts表达组）更高，表明对5′utr重复序列基因分型有助于指导个体氟尿嘧啶化疗。高长明等［17］研究发现携带ts6/6bp和6/+6bp基因型患者化疗有效率显著高于+6/+6bp基因型患者。villafranca f等［18］研究也认为ts重复序列多态性可作为肿瘤降期的预测指标。ts基因多态性的研究有可能为化疗方案制订及预后评估提供了理论依据和指导。
2.4 ts及其基因多态性预测肿瘤化疗疗效存在局限性
不少学者认为，ts表达水平和ts基因型检测可以预测肿瘤患者对化疗药物的敏感性和化疗疗效。然而有资料显示，ts的表达与氟脲嘧啶有效性呈负相关的结论并不成立。lecomte等［19］对90例大肠癌研究表明，5′utr多态性和3′utr多态性与5fu疗效和生存率无关。
出现这种相反观点，一方面,可能在实验过程中,电泳条件的差异和酶切不完全而产生假阴性,影响 ts 基因型的检测结果,从而导致结论不一致;另一方面,影响肿瘤对5fu的敏感性有多种因素。除检测了ts,胸苷磷酸化酶(tp)、胸苷激酶(tk)、二氢尿嘧啶脱氢酶(dpd)等与5fu代谢密切相关的其他酶应该检测而没有检测,因而具有一定的局限性。p53、多药耐药基因和多药耐药相关基因等多种基因也是化疗疗效的影响因素。
2.5 ts相关耐药逆转
临床化疗失败重要原因是肿瘤细胞产生耐药性，寻找耐药逆转剂是抗肿瘤药物研究的重要策略之一。目前逆转ts高表达耐药常用的是ecta方案、5fu联用甲酰四氢叶酸(lv)或干扰素γ。 ecta方案使用nb1011等酶催化无毒性试剂。该无毒性试剂经ts的催化才有毒性,所以对ts高表达耐药癌细胞杀伤力强，而对正常细胞杀伤力弱，对ts诱导耐药效果显著,是一种理想逆转剂。联用lv或干扰素γ能降低ts诱导而避免继发性耐药发生。引导肿瘤细胞凋亡是化疗最终途径,5fu抑制ts,可能通过肿瘤细胞表面fas受体和fas配体结合而引导细胞凋亡［20］。这涉及信号传导过程，因而有人提出了免疫治疗方法。
ts抑制剂化疗时，肿瘤细胞可出现ts诱导而耐药。ferguson［21］等设计了与tsmrna3'utr互补的反义寡核苷酸，使tsmrna水平被抑制了70%，细胞增殖被抑制40%以上。两者联合治疗可能克服ts上调所致的耐药。peters等研究表明，高ts活性引导的肿瘤耐药，在合并存在高dpd活性时明显增强；对进展期结肠癌，低tsmran／低dpdmrna者使用5fu和亚叶酸钙，高tsmrna／高dpdmrna者使用草酸铂及cptⅱ，取得良好的临床疗效［22］。
2.6 基因治疗
肿瘤的基因疗法特别是自杀基因疗法倍受关注，其原理是将自杀基因导入肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可将原先无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞自杀。肿瘤自杀基因治疗用于临床，关键是使目的基因在肿瘤细胞异性表达，避免导入正常组织细胞中，保证基因治疗安全性。为此，在自杀基因前端接上一个肿瘤特异性的启动子，可以使自杀基因呈肿瘤特异性表达。于波等［23］将ts基因启动子、p16基因启动子重组质粒载体转入耐药hr8348细胞研究结果表明，ts和p16双启动子可引导tk基因靶向性杀伤5fu耐药肿瘤细胞，保护机体正常细胞，提高自杀基因治疗的安全性。黄慧敏等［24］通过逆转录病毒载体介导的rna干扰（rnai)技术，能够间接抑制tsmrna的表达，为高表达ts的肿瘤基因治疗提供了新的思路和手段。
2.7 ts、ts基因多态性与肿瘤侵袭性和预后
不少研究显示，肿瘤ts的表达水平与患者的预后呈负相关， ts的表达可以作为判断癌症患者预后的指标。余之刚等［25］检测164例胃癌标本显示， ts表达水平高低与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期密切相关。ts高表达预示着肿瘤具有较强的侵袭性，ts基因产物低表达患者的局部复发率和远处转移率均明显低于高表达患者。它在dna合成中发挥作用,过度表达ts肿瘤细胞群可能具有优势潜能，高ts表达与不良预后相关可能是细胞增生状态的反映。也有学者研究得出不同结论，董稚明等［26］通过51例食管癌标本ts表达检测结果表明，ts表达水平与患者淋巴结转移和临床病理分期无关。
肿瘤病变的分子特征决定了肿瘤的恶性特征、转移特征、复发特征，是肿瘤的预后判断的基本依据。董稚明等［26］研究提示，ts 5'utr多态性分析可能作为预测食管鳞状细胞癌淋巴结转移能力的分子指标。可见人群基因型可能与肿瘤分级、分期有关，对预测肿瘤预后有一定意义；对肿瘤进行分子分型,可能会使医生对病情和发展趋势的预后判断更细致、更正确，对疗效监控情况更清晰。
3 结束语与展望
化疗在肿瘤综合治疗中有着重要的价值，耐药仍是肿瘤化疗一大难题。不同学者报道结论有所不同，这可能由于随着研究人群、年龄、地域、观察终点和方法不同而有所差异。组织大样本随机对照研究，系统评估,进一步研究ts及其基因多态性与肿瘤关系,将有助揭开肿瘤细胞耐药的机制。根据ts、ts基因型检测指导个体化疗，可提高用药针对性和有效性，减少用药的盲目性及其毒副作用。不少学者认为，ts及其基因型检测有望成为预测肿瘤发生、化疗疗效评估、预后判断的指标，将为肿瘤防治带来美好前景。未来个体化医学，相信会建立在循证医学基础上，以基因组学和蛋白质组学为依托的个体化肿瘤综合诊疗模式。但目前国内外对ts基因3′utr 多态性、snp和肿瘤的基因组不稳定性报道不多,对ts相关耐药的逆转和有关ts基因治疗研究甚少，有待进一步研究。
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【摘要】 目的 研究Med19基因在胃癌MGC803细胞中沉默后对细胞增殖和周期的影响。方法 应用shRNA慢病毒载体感染胃癌MGC803细胞沉默Med19基因，通过MTT和克隆形成实验观察Med19基因在胃癌细胞增殖中的作用，并用流式细胞术验证抑制Med19基因对细胞周期的影响。结果 构建的shRNA慢病毒载体感染MGC803细胞后细胞增殖能力显著降低、细胞克隆形成能力明显减弱，同时，细胞周期阻滞于G1期。结论 Med19基因沉默后胃癌细胞的增殖能力和细胞周期均受到显著影响，提示Med19在肿瘤形成过程中具有重要作用。
【关键词】 胃癌;Med19;RNAi;增殖;细胞周期
中介体(Mediator)最早发现于酵母菌中，是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物，属于RNA 聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分，在真核生物mRNA 合成的活化和抑制中发挥关键作用，对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节〔1～3〕。哺乳动物中介体的亚基组成及其相关活性已经确定，目前已鉴定30余种亚基，其中多数亚基与酵母的中介体亚基存在广泛的同源性〔4，5〕。Med19是中介体其中一个亚单位，又称为肺癌转移相关蛋白(lung cancer metastasis related protein l， LCMR1)。最初由高转移肺癌中克隆得到，已被证实参与细胞信号由胞外向胞内转导。抑制Med19基因，可引起某些调节细胞生长、细胞分化和凋亡的基因的表达发生改变，提示Med19可能参与细胞周期调控、信号转导或转录调控〔6〕。本研究利用慢病毒介导的RNAi方法在胃癌MGC803细胞中沉默Med19基因，观察其影响细胞增殖和细胞周期的能力，从而对Med19基因在胃癌中的功能进行验证。
1 材料与方法
1.1 Med19基因shRNA 慢病毒载体的构建 靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′，由上海生工公司合成短发卡结构的双链DNA(shRNA)，重组进入慢病毒质粒pLVTHM，转化大肠杆菌感受态细胞并挑选重组克隆进行菌落PCR鉴定，测序验证后的shRNA慢病毒载体大量扩增，与包装辅助质粒psPAX2、pMD2G共转染至病毒包装细胞293T，12 h后换液，转染72 h收集细胞上清，并裂解细胞，用微孔滤膜过滤除菌，超速离心后弃上清液，用冰PBS溶液重悬病毒沉淀，得到shRNA慢病毒包装颗粒，有限稀释法通过荧光观察标定病毒滴度。
1.2 慢病毒介导RNAi沉默Med19基因的效率验证 pLVTHMsiMed19载体包装的慢病毒颗粒感染胃癌MGC803细胞，72 h后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，通过计算在白光下细胞总数与绿色荧光细胞的比值，得到GFP的阳性表达率，可知慢病毒对MGC803细胞感染率达到85%以上。感染后的第5天抽提细胞总RNA，通过RTPCR法检测shRNA慢病毒对Med19 mRNA表达的抑制作用;同时裂解细胞收集总蛋白，Western印迹法验证Med19蛋白水平表达的变化，确认shRNA慢病毒对Med19基因的阻断效应。
1.3 MTT方法检测细胞增殖情况 实验共分为三组：shRNA慢病毒感染组(shRNA组，靶向Med19基因的shRNA慢病毒)、非特异性的shRNA阴性对照病毒感染组(NC组，对照序列shRNA慢病毒)和空白对照组(C组，MGC803细胞未作任何处理)。取对数生长期细胞MGC803细胞接种于96孔板中，计数细胞每孔2 000个，每组5个复孔，接种5块复板。接种第2天加MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，4 h后吸出培养基，加入DMSO 100 μl/孔。5 min后酶标仪检测OD570吸光度值，连续检测5 d。每天一块复板。根据MTT读值绘制细胞生长曲线。
1.4 细胞克隆形成实验 实验分组同前，shRNA慢病毒感染后的MGC803细胞制备成细胞悬液，接种于6孔板，每孔200个细胞，将接种好的细胞于37℃、5% CO2培养箱中继续培养到绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途进行数次换液并进行细胞状态观察，连续观察14 d。实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，终止时用PBS溶液洗涤细胞2次，多聚甲醛固定细胞40 min，PBS溶液再次洗涤后用GIEMSA染色液对细胞染色10 min，去离子水清洗细胞3次去除背景，晾干、拍照和计数克隆。
1.5 流式细胞仪检测细胞周期 实验分组同前，感染shRNA慢病毒的MGC803细胞接种于6孔板中，细胞固定时先用胰酶消化，待细胞呈圆形未脱落时，完全培养基终止，4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次，2 000 r/min、5 min收集细胞，然后边震荡边加入70%的冰冷乙醇1 ml固定细胞，4℃过夜。冰PBS洗涤细胞2次后，2 000 r/min离心5 min收集细胞1 ml冰PBS溶液重悬细胞沉淀，分别加入PI(1∶40)及RNase(1∶100)，避光冰浴15 min，上机进行流式检测。
1.6 统计数据处理 数据采用软件SPSS16.0进行统计学分析，应用一维方差分析比较显著性。
2 结 果
2.1 shRNA慢病毒介导Med19基因沉默效果 采用针对Med19基因的PCR引物，以βactin为内参，进行mRNA的定量检测。shRNA慢病毒感染组(shRNA组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和空白对照组(C组)mRNA结果见图1，mRNA水平基因抑制效率达到78.4%。同时，Western印迹实验结果中同样证实shRNA组Med19蛋白的表达量与NC组相比明显减少，表明shRNA慢病毒感染MGC803细胞后可以高效抑制Med19蛋白的表达，见图1。
图1 shRNA慢病毒在MGC803细胞中
对Med19基因的抑制效率
2.2 shRNA慢病毒介导Med19沉默抑制胃癌MGC803细胞增殖 在MTT实验方法中，OD570nm处的吸光值可间接反映出细胞增殖的情况，即OD570 nm值越大，细胞活力越强。MTT法检测转染后1～5 d各组细胞的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。对各组细胞同一检测点的吸光度值进行统计分析，结果显示，Med19 shRNA慢病毒感染组MGC803细胞的570 nm OD值显著低于其他两组，表明MED19基因沉默后MGC803细胞增殖明显受到抑制，细胞活力下降，而阴性对照组和空白对照组OD570 nm值基本一致，说明慢病毒本身对MGC803细胞增殖能力无影响，从而也证实由于shRNA慢病毒介导了MGC803细胞中Med19基因的沉默导致了细胞增殖能力下降，见图2。
图2 MGC803细胞增殖曲线
2.3 Med19基因沉默降低MGC803细胞克隆形成能力 从单个克隆看，阴性对照组和空白对照组细胞数目较多且两组相差不大，而shRNA慢病毒感染的MGC803克隆中细胞数比其他两组显著减少，见图3。同时，克隆计数结果表明，Med19沉默后细胞克隆数(42.7±7.1)与阴性对照组(124.3±22.8)和空白对照组(147.3±28.5)克隆数相比显著降低，表明抑制Med19基因能够降低胃癌MGC803细胞克隆形成能力。表1 PI染色流式细胞仪检测细胞周期结果
2.4 Med19基因沉默引起MGC803细胞周期阻滞于G1期 应用PI染色细胞进行流式细胞术观察Med19基因沉默后对胃癌MGC803细胞周期的变化。从表1数据可以观察到，与阴性对照相比，抑制Med19能够使G1期细胞增多，G2/M期细胞减少，差异具有显著性。由此可见Med19基因RNAi后细胞周期阻滞于G1期，细胞复制能力降低，验证了其表达对胃癌细胞具有促进增殖的作用(图4)。
图4 MGC803细胞周期峰型图
3 讨 论
在世界范围内胃癌死亡率居恶性肿瘤第二位，由于饮食结构等因素影响，目前全球约60%的胃癌新发病例发生在中国、日本等东南亚国家。外科手术是目前胃癌治疗的最有效手段，但术后5 年生存率较低。据2009年统计，胃癌病人术后5年的总体生存率低于25%〔7〕。胃癌发生的分子基础是以癌基因的激活与抑癌基因的失活为基础的多步骤、多阶段效应过程，通过这些基因表达产物的改变，引起细胞恶性增殖、去分化和侵袭性生长，从而导致癌变过程。从治疗策略看，控制癌基因的激活和抑癌基因的失活能够阻断肿瘤的发生。自RNA干扰(RNAi)技术应用以来，其高效性、特异性和低毒性使得该技术在反向基因组学、基因治疗、抗肿瘤、抗病毒、抗遗传性疾病以及胚胎干细胞的研究中显示了巨大的潜力〔8，9〕。
Med19基因在酵母中又名ROX3 (或SSN7、RMR1等)，最初是在观察cyc7基因突变时发现的〔10〕，研究证实Med19编码产物属于中介体和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亚基〔11〕。Med19/Rox3构成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的头部组件〔12，13〕。缺失Med19/Rox3能够导致中介体中部组建的解离，仅保留由头部和尾部模块组成的亚复合体，提示Med19可稳定中部组件在中介体的位置，而对头部和尾部组件无影响。此外，突变的Med19/Rox3中介体对RNA聚合酶Ⅱ的亲和力下降，无法刺激 RNA聚合酶Ⅱ亚基羟基端结构域(Carboxy terminal domain， CTD)的磷酸化〔14〕。最近，Med19和Med26被确定为沉默转录因子RE1操纵的调控装置的重要组分〔15〕。RE1沉默转录因子以Med19/Med26为桥梁招募中介体，以使非神经元细胞中的神经元特异性基因实现表观遗传沉默。
Med19在肿瘤中的研究还不完善，但关于Med19在胃癌组织中的表达问题已在本人的前期研究中得到证实和阐述，应用免疫组化组化方法检测Med19在胃癌、癌旁和正常组织中的表达，证实Med19在肿瘤组织中的高表达具有特异性，该基因的表达上调可能涉及胃癌癌变的发生。但是Med19对细胞增殖和周期的影响尚未阐明。我们在沉默Med19基因后，通过MTT法、克隆形成实验、流式细胞仪测定细胞周期以及Transwell实验观察细胞侵袭转移能力的变化，结果显示RNAi组与对照组相比， MGC803细胞的增殖能力显著降低，克隆形成能力减弱，细胞，细胞周期出现G1期阻滞，但对细胞的侵袭转移能力没有显著的影响。本部分实验证实了利用RNAi技术抑制胃癌细胞Med19基因，能够有效地抑制胃癌细胞的恶性表征，提示在胃癌中靶向基因治疗中Med19可能成为有效的靶位点，具有良好的应用前景。
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关键词：人工核酸内切酶：基因编辑：CRISPR/Cas9
中图分类号：Q789
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2015）03-0276-07
基因组定点编辑技术是研究基因功能的一种重要手段，同时也是许多基因相关疾病的潜在治疗方法。早期主要依赖于基因同源重组及体细胞核移植技术来完成对特定基因的改造，然而自然情况下基因重组效率极低，且细胞核移植技术费时费力[1，2]，严重制约了基础研究和临床应用。因此，在不断寻求高效、简便的基因编辑方法过程中，人工核酸内切酶（engineered endonuclease.EEN）介导的基因定点编辑技术快速发展成为一种主流方法。
人工核酸内切酶进行基因编辑的第一步是在修饰位点诱导产生DNA双链断裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。核酸酶诱导产生的DSBs可借助非同源末端连接（non homologous end-join-ing，NHEJ）机制或同源重组（homologous recombi-nation，HR）机制进行修复。NHEJ将断裂的双链末端直接连接起来，可有效地引起基因的插入/缺失突变，即inclel突变，从而使基因的功能遭到破坏。当引入模板DNA序列时，可通过同源重组修复（HR），插入或删除特定的基因序列。通过人工核酸内切酶介导的DSBs，基因突变的几率大于1010，有时甚至超过50%[3] ，因此，人工核酸内切酶被称为“DNA剪刀”。锌指核酸内切酶（zinc finger en-donuclease，ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶 （Lranscriplion activator-like effector nuclease，TALEN）分别作为第一代和第二代“DNA剪刀”，都是由DNA结合蛋白与核酸内切酶Fok I融合而成。但由于这两种人工核酸内切酶制备复杂，成本昂贵，难于开展大规模基因编辑的筛选，使其应用有所局限。近年来，细菌获得性免疫系统CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalinclromic repeats）的应用使得基因组编辑技术进一步简化.CRISPR/Cas9作为第3代人工核酸内切酶迅速成为目前研究的热点，其独特性和灵活性在于该系统是通过RNA介导核酸酶与靶DNA序列结合的。与以DNA结合蛋白为基础的ZFN和TATJFJN相比，以RNA介导的CRISPR/Cas9系统原理更加简单，只需要遵循RNA与DNA之间的碱基互补配对原则。
本文重点介绍了CRISPR/Cas9的作用机理及其应用，最后就CRISPR/Cas9技术目前存在的问题及其应对策略进行了探讨。
1 CRISPR/Cas9的结构及作用机理
CRISPR广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，该系统可以介导外源DNA的降解，从而抵御病毒等外来入侵者[4，5]。1987年，日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列[6]；2002年，Jansen等[7，8] 将其正式命名为CRISPR，基因编码的蛋白质统称为CRISPR附属蛋白（CRISPR-associa七ion pro-teins，Cas）。CRISPR/Cas系统具有Type I、TypeⅡ、TypeⅢ3种不同类型，其中研究最多、应用最广的是Ⅱ型CRISPR/Cas系统。产脓链球菌（Strepto-coccus pyogenes SF370）的Ⅱ型CRISPR基因座主要由三部分组成，包括Cas9核酸酶基因、不编码蛋白质的tracr RNA基因和CRISPR基因（图1），其中CRISPR基因由前导序列（leader sequence）、间隔序列（ spacers）和重复序列（repeats）组成[9] 。CRISPR/Cas9系统介导的适应性免疫主要分为3个步骤。首先是新的间隔序列的获取：外来质粒或病毒DNA首次入侵时，Ⅱ型CRISPR系统将外来DNA整合入CRISPR重复序列之间形成一段新的间隔序列，并随着宿主DNA -起编码；其次是crRNA的表达、加工与成熟：CRISPR重复序列和间隔序列经转录加工为pre-crRNA，tracrRNAs与pre-crRNA的重复序列区域配对杂交，然后内源性的RNaseⅢ从每一个间隔序列的5'端裂解杂合的pre -crRNA -tracrRNAs，产生成熟的tracr-RNA-crRNAs，并与Cas9核酸酶结合[10] ；最后，当同样的外源DNA再次出现时，CRISPR-Cas复合体可与双链DNA的靶位点结合并切割双链。靶标的识别和DNA链的裂解既需要间隔序列和靶序列之间的互补，又需要靶DNA序列3'端存在PAM （Protospacer adjacent motif）序列[11]，PAM序列的存在还避免了CRISPR基因本身被作为靶标识别，提供了一个识别“自己”和“异己”的机制。不同的Ⅱ型CRISPR系统有不同的PAM序列，基于产脓链球菌CRISPR系统的PAM序列为NGG，N指的是任意核苷酸[10] 。
Cas9实际上是一种核酸酶，它具有两个独立的核酸酶位点：一是HNH核酸酶位点，可以断裂与crRNA互补的那条链；另一个是类似于RuvC核酸酶位点，可以裂解另一条非互补链。研究[12，13]发现Cas9家族的所有成员都具有相同的结构核心，这个结构核心的特征为一种具有两个主叶（major lobe）-核酸酶结构域叶和a-螺旋叶的结构，其中核酸酶结构域叶是由HNH结构域、RuvC结构域以及与PAM序列相互作用的C末端结构域组成。这两个主叶含有保守性的裂缝，而这些裂缝在核酸结合中发挥功能。Cas9蛋白本身以非活性的状态存在，它的核酸酶活性被C末端结构域的方向所抑制，而且不能与DNA结合；但当其与crRNA-tracrRNA复合体结合时，这种蛋白的两个主叶之间就会构建出一条作为DNA结合界面发挥功能的通道，从而在结构上激活Cas9，使得它能够与靶DNA结合，PAM序列则将其核酸酶活性激活[12―14]。
2 CRISPR/Cas9系统的应用
目前，来自于产脓链球菌的Ⅱ型CRISPR系统已被改造为基因组定点编辑的工具。该系统具备两个最基本的成分：一个是起识别作用的cr-RNA-tracrRNA序列，另一个是起切割作用的Cas9核酸酶。在对哺乳动物细胞进行基因编辑时，需要对Cas9蛋白编码基因进行优化以及添加合适的核定位信号；此外，还需考虑是分别表达crRNA和tracrRNA还是嵌合成一条crRNA -tracrRNA，crRNA -tracrRNA又称向导RNA（ gR-NA）c15]。
自2012年首次证明CRISPR/Cas9系统可以在体外切割不同的DNA[10]以来，该系统已经成功地应用于细菌、酵母、番茄、拟南芥、大米、小麦、高粱、鼠、兔子、青蛙、果蝇、蚕、线虫、斑马鱼及人类细胞等的基因编辑中[3]。与其他人工核酸酶相比.该RNA介导的基因编辑系统一个显著的优势就是可以同时在多个不同的DNA位点进行基因编辑。例如，Cas9和多个gRNAs的同时表达，可在DSBs间造成大片段的删除和插入[16，17]；可在鼠细胞中同时诱导3个基因的突变[18]；在斑马鱼体细胞中导致5个基因的同时突变等[19]。
Cas9除了可以用于基因的编辑外，还可以对基因的表达进行调控。当Cas9核酸酶的两个催化位点全部突变时，Cas9就变成了没有核酸酶活性的蛋白质（称为dCas9）；研究表明，dCas9可以结合在基因的启动子上来抑制基因的表达[20，21]。当gRNA结合在启动子的上游时，无论其结合在DNA的哪条链上，dCas9都可以有效地抑制转录的发生；然而，当结合在转录起始位点的下游时，只有当gRNA结合在非模板链时，dCas9才能起抑制作用[20]。此外，dCas9还可以作为一个平台招募各种效应因子结合在特异的基因位点上。例如，在人类细胞[22-25]和小鼠细胞[2q中，结合转录激活子或者转录抑制子的dCas9可以对基因的表达起到调节作用（图2A）。并且，如果有2―10个gRNA介导多个转录因子结合在同一基因位点，可以进一步提高基因调节的效率，推测与转录因子之间的协同作用相关[22，23，26，27]。也有研究利用EGFP-dCas9融合物来识别包含重复序列的DNA位点，例如端粒[28]（图2B），若DNA位点包含有重复序列，则会结合有多个EGFP蛋白，为研究染色体的动力学和结构提供了一种有力的手段，并且使Cas9系统的应用不仅局限于基因的表达范围。
这种简便高效的CRISPR/Cas9技术填补了哺乳动物细胞内基于基因完全敲除而进行的大规模基因功能性筛选方法的空白，可以针对细胞全部基因或某些基因构建gRNA文库，然后经过慢病毒载体转染进行大规模的筛选。已有研究团队针对人类的部分291个基因构建了包含有869种gRNA的文库，并且成功地鉴别出了对于炭疽和白喉毒素毒性事关重要的宿主基因[29]。也有研究报道针对人类或小鼠的全部基因组构建了包含有64 000～87 000条gRNA的文库，通过高通量的敲除技术对人类和小鼠细胞进行了基因的功能性筛选鉴定[30-32]。其技术路线大致相同，都是通过构建gRNA慢病毒表达载体来感染细胞，然后通过功能性筛选鉴定细胞，最后经过二代基因测序[33] 确定相关的基因。不同之处在于，有的团队[31]将gRNA和Cas9串联表达在同一个慢病毒表达载体上，通过感染将二者一次性转入细胞；而有的团队[30，32] 将二者分别克隆在不同的载体上，先获得稳定表达Cas9的细胞，然后再进行gRNA慢病毒的感染。尽管RNA干扰（RNA interference，RNAi）文库[34]也曾被广泛应用于功能缺失型基因筛选，但是与gRNA文库相比，RNA干扰只是下调某些基因的表达，常常造成不稳定的表型变化，并且文库构建繁琐，价格昂贵；而gRNA文库的构建和筛选都非常的简单，在基因的功能性筛选鉴定方面发挥了重要作用。
除此之外，CRISPR-Cas系统也可以用来快速地建立转基因细胞和动物模型。一些人类疾病例如糖尿病、心脏病、精神分裂症是与多个基因有关的，CRISPR多基因同时编辑的特点为这些疾病模型的建立提供了很好的方法[35，36]。利用传统方法建立动物疾病模型要花费1年多的时间，而使用CRISPR技术只需几周即可完成。而且，传统方法只能用于传统动物的建模，灵长类动物体内基因精确修饰一直是个难题，但最近一个研究小组在猴子体内利用CRISPR/Cas9系统实现了精确的基因修饰[37]为我们提供了一种研究人类疾病的新策略。
3 CRISPR/Cas9系统的脱靶效应及提高特异性的策略
【关键词】胃肿瘤；抑癌基因；Runx3
Runx3（PEBP2αC/CBFA3/AML2）基因是一个肿瘤抑制基因，其功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展有关。自2002年日本学者Li等［1］首先报道Runx3有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用以来，Runx3与胃癌发生、发展的相关研究已成为胃癌研究领域的热点。现对Runx3与胃癌的研究现状做一综述。
1Runx3基因、蛋白结构及其功能
Runx3来自Runt结构域转录因子（Runtdomaintranscriptionfactors），是转录因子Runx家族成员之一，Runt区域转录因子也称PEBP2/CBF（polyomavirusenhancer-corebindingprotein2/corebindingfactor），是TGF-β超家族信号重要的靶目标，在哺乳动物生长过程中扮演重要角色。该基因家族在哺乳动物有3个成员Runx1、Runx2、Runx3，它们的产物都是由α和β亚单位构成的异二聚体［2］，具有不同生物学功能，Runx1与造血功能有关，Runx2是重要的骨生成调节因子，Runx3对脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生调控和T细胞的分化起重要作用［1，3］。
Runx3（Runtrelatedtranscriptionfactor3gene）基因位于人染色体的1p36.1，基因全长约67kb，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1290bp的开放阅读框，内含子1跨越了整条基因全长的一半（35kb）。两个启动子区域均含数个分离的转录起始点，其中Runx3mRNA主要来自于P2启动子的转录［3］。两个启动子的GC含量不同，P2启动子GC含量高（64％）。在外显子2相当于启动子P2的位置和外显子6的起始部位有两个大CpG岛［4］。
人类Runx3蛋白是α、β两个亚单位构成的异二聚体，包含415个氨基酸残基，α亚单位含有一个RD（Runtdomain）保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128个氨基酸组成，介导Runx蛋白与DNA结合以及蛋白质之间的相互作用［5，6］。α亚单位介导RD与靶DNA结合，β亚单能增强RD与靶DNA的结合力［7］。
Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸，对基因的转录调控起重要作用［2，7］。
2Runx3与胃癌的相关研究及其抑癌机制
2.1Runx3与胃黏膜的关系Li等［1］研究发现敲除Runx3（Runx3-/-）的小鼠胃黏膜明显增厚，Runx3-/-小鼠培养细胞对TGF-β诱导的生长抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃组织中半胱天冬酶3（caspase3）无活性［1］。Fukamachi等［8］研究发现Runx3缺失时胃黏膜细胞处于低分化状态。这些观察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生长调控因子，是胃上皮细胞中重要的致凋亡因素。
2.2胃癌中Runx3表达情况研究发现，胃癌中Runx3的表达明显下调或缺失。Li等［1］应用RT-PCR、Southernblot和原位杂交方法对15株胃癌细胞系和46例胃癌组织标本的Runx3mRNA表达进行检测，结果发现47%的胃癌细胞系中Runx3无或低表达;60.9%的胃癌组织中Runx3无表达或低表达，Runx3的表达率与胃癌临床分期呈负相关。所以认为Runx3基因与胃癌的发生、发展有着极其密切的关系，并且随着胃癌分期的增高表达进一步降低。Osaki等［9］应用Western印迹法分析了6株胃癌细胞系Runx3蛋白质的表达情况，结果50%的细胞系Runx3表达阳性，与Li等报道的结果基本一致;此外，还通过免疫组化法揭示83例正常胃黏膜组织均有Runx3表达，而对应的肠上皮化生组织和癌组织中均无Runx3表达［9］。
2.3Runx3与胃癌的相关性Li等［1］报道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培养细胞能建立裸鼠种植肿瘤（腺癌），而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培养细胞则不能，这表明Runx3功能缺失可能诱导了胃癌的发生。Guo等［10］以胃癌细胞系（Runx3-/-）作为感受态细胞，将外源性Runx3基因分别转染克隆体，结果显示，Runx3高表达克隆组细胞生长抑制最明显，Runx3低表达组次之，说明Runx3的表达量与胃癌细胞的生长曲线成负相关。Sakakura等［11］研究发现胃癌原发灶和腹膜转移灶Runx3mRNA表达较正常胃黏膜明显下调，尤以腹膜转移灶下降程度最著。将转染外源性Runx3的胃癌细胞系注入裸鼠腹腔，结果转染组腹腔内极少有种植结节，而无转染对照组动物腹腔内有大量的、明显的种植结节形成。因此认为Runx3基因的失表达与胃癌的腹膜转移发生有关。Wei等［12］揭示胃癌组织中Runx3表达水平与患者的生存期密切相关。Peng等［13］通过对120例胃癌组织中Runx3表达与血管内皮生长因子（VEGF）表达的相关分析，揭示Runx3的转录可能与胃癌组织中VEGF的表达下调有关。因此Runx3基因沉默可能会加速胃癌的生长和远处转移。
2.4Runx3抑癌机制Runt区域转录因子与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应。TGF-β与其跨膜受体Ⅰ和Ⅱ（TβRⅠ和TβRⅡ）结合，产生受体异四聚体复合物（TβRC），从而发挥细胞内生物效应［14］，此过程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信号转导通路的配体、受体和胞内信号转导分子Smad蛋白共同组成一个抑制肿瘤信号的通路。通路异常即可引起信号紊乱，促进多种肿瘤的发生和发展［15］。Runx3蛋白是TGF-β信号通路下游的一个转录因子，Runx蛋白与DNA结合，在TGF-β/BMP（bonemorphogeneticprotein）信号传导中起重要作用。只有在Runx蛋白的参与下，Smad复合物才能从细胞质内转入核内的功能靶点，与Runx蛋白共同转录激活靶基因，从而对细胞的分化、周期调控、凋亡和恶性转化起作用［16］。当Runx基因表达受抑制时，影响TGF-β信号通路的转导，从而诱导肿瘤的发生。
Chi等［17］研究显示Runx3是p21基因的下游调控子，p21在细胞生长周期中有重要作用，其通过抑制周期素依赖性蛋白激酶（cyclin-dependentKinase，CDK）表达而使细胞周期停滞于G1期。p21启动子包括5个Runx结合位点，即3个完全匹配的a、b、c位点和2个部分匹配的d、e位点，当Runx结合域突变时，p21启动子的活性明显降低，而Runx3和Smad3协同表达时p21启动子被激活，从而使细胞对TGF-β反应增强。Runx3的抑癌活性与其诱导p21表达的能力相关，p53也是通过调控p21表达活性来调节细胞生长周期，故两者作用机制类似，但作用的信号通路不同。最近有研究显示恢复Runx3表达可导致cyclinD表达下调，相反p27和caspase3、7和8则表达上调。这可能是Runx3诱导凋亡的潜在机制［14］。
因此，Runx3抑癌机制主要通过TGF-β信号通路协同Smad蛋白激活p21调节细胞生长周期，并通过下调cyclinD表达和上调p27和caspase3、7和8的表达而诱导凋亡。
3胃癌中Runx3基因表达降低或缺失的机制
3.1Runx3基因突变与表达基因突变是抑癌基因沉默的主要机制之一，然而文献报道突变不是Runx3表达下调的主要机制［1，12，18］。
3.2Runx3基因杂合性缺失与表达Li等［1］应用荧光原位杂交技术（FISH）对15个胃癌细胞系和46例胃癌组织Runx3DNA倍体进行分析，结果发现20%的胃癌细胞系和30%的胃癌组织中的Runx3为异倍体。并采用RT-PCR方法和原位杂交方法分别对这些发生杂合缺失胃癌细胞系和胃癌组织标本进行Runx3mRNA表达的检测，发现除1例胃癌组织可以检测到Runx3mRNA表达外，其余均无Runx3mRNA表达。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在杂合缺失，2例Ⅱ期胃癌没有发现杂合缺失，14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3存在杂合缺失，8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都发生杂合缺失变化，说明Runx3的杂合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一，并且Runx3的杂合缺失和胃癌的分期有关。
3.3Runx3甲基化是胃癌中Runx3表达下调的主要原因启动子异常甲基化在基因表达调控、DNA修复、基因稳定及基因抑制方面起重要作用。Runx3启动子P2区域有一个典型CpG岛，理论上说明DNA甲基化可调控P2的转录。
Li等［1］揭示Runx3低表达或失表达都与Runx3启动子P2区域CpG岛过甲基化有关。Guo等［10］用N2甲基2N2亚硝基脲诱导鼠胃癌，从中建立4株胃癌细胞系，结果仅一株细胞系有微量的Runx3mRNA表达，其他3株细胞系均无Runx3mRNA表达，这3株Runx3基因沉默细胞系在Runx3启动子区域亦存在明显甲基化，所有细胞系经过DNA甲基化转移酶抑制剂52氮唑22脱氧胞苷（deoxycytidine，AZA）、组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌素（trichostatin，TSA）共同处理后均恢复了Runx3表达。Waki等［19］检测了10株胃癌细胞系、93例胃癌组织及相应正常胃黏膜组织Runx3基因启动子甲基化状态，结果7株胃癌细胞系、42例胃癌组织和7例正常胃黏膜组织存在甲基化。此外，对19例尸检的正常胃黏膜组织Runx3甲基化状态进行检测，其中3例存在甲基化，但年龄均≥77岁，提示除高龄患者外Runx3甲基化几乎是癌特异性的。Kim等［20］对75例胃癌和各种胃癌前期病变组织（胃腺瘤77例、慢性胃炎伴肠上皮化生32例和慢性胃炎不伴肠上皮化生99例）Runx3甲基化状态进行检测，结果发现在胃癌组织中Runx3甲基化发生率为64%，而在各种胃癌前期病变组织中也存在不同程度的Runx3甲基化，其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴肠上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴肠上皮化生8.1%。而在有腹膜转移的胃癌标本100%发现Runx3甲基化［11］。因此认为Runx3甲基化发生随癌前期病变向癌的方向发展而增加，从原位癌到进展期胃癌Runx3甲基化率随之升高，说明Runx3甲基化从胃癌的发生到胃癌的发展都有很重要的意义。Homma等［21］发现，大多数胃癌细胞系（90%）、胃癌组织（96%）和配对的正常胃黏膜组织（96%）均存在Runx3基因5′端CpG岛的甲基化，而在被视为导致基因沉默的关键部位——转录起始点附近区域的甲基化发生率较低，分别为40%、53%和11%。因此认为，Runx3基因高甲基化起初发生在5′端CpG岛，进而向转录起始点区域扩展，最终导致Runx3mRNA失表达，Runx3基因CpG岛多区域甲基化状态检测对胃癌的诊断及风险评估具有重要意义。
4小结
Runx3作为一个新发现的抑癌基因，在调控细胞生长、发育、凋亡和以细胞的信号传导及其他生物学效应方面有着重要的转录调节作用。其启动子P2区域CpG岛的过甲基化和杂合缺失是Runx3基因沉默的主要机制。Runx3的转录失活或表达下调可致胃黏膜上皮细胞的过度增生和分化异常，进而参与胃癌的发生和发展过程。Runx3有望成为一个恶性肿瘤，特别是胃癌发生发展的生物学标记物和肿瘤基因治疗的靶点（如Runx3基因的导入、逆转甲基化治疗等），有可能为胃癌等恶性肿瘤的诊疗提供新的策略和方案。
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【关键词】高中；生物；生活；方式；学生
生物课程与现实生活具有不可分割的关系，使高中生物课堂回归现实生活，为提升课堂教学有效性开辟全新路径。当前阶段高中生物课堂回归生活的方式已经成为现阶段教师群体广泛热议的话题。
一、知识导入侧重强调生活性
新知识的导入环节直接决定着以后的学习效果，为了有效构建生活化高中生物课堂，教师需要在设计导入环节时，紧紧围绕生活性要求，有意识的引导学生分析生物知识，深化学生生物知识源于现实生活的观念，生物知识是无法脱离生活独立存在的。在实际设计生活化教学活动时，需要积极创设生动风趣的教学情景，引导学生借助实践操作由原本的感性认知上升至理性层面，这也就需要将生活中较为熟悉的情景或物质作为切入点，更容易被学生所接受理解。现阶段高中生已经具备了独立的学习思维，在设计教学内容过程中，教需要充分考虑学生的学习情况，在新课导入环节侧重引入生活实例，积极创设多元化生活情境，激发学生的学习兴趣，调动学生的学习兴趣，进而有效加深学生的学习印象[1]。
如：教师在教学人教版高中生物人教版必修二《人类遗传病》这一课时，教师需要在上课时戴着口罩走到教室，并提出问题：“最近我晚上睡觉有些着凉感冒了，所以我要带着口罩为你们讲课，那么感冒发热是不是遗传病？为什么？”引导学生翻阅教材寻找问题答案如：遗传病是由于人的生殖细胞或受精卵里遗传物质发生改变而引起的人类遗传性疾病，而感冒发热是由感冒病原体引起的传染病，两者有着根本的区别。在学生具备一定基础上，要求学生以小组为整体讨论“什么是健康的孩子？怎样才能做到优生”的问题，以此来帮助学生了解人类基因组计划的基本内容、正负面影响，知道基因诊断、基因治疗的基本知识。
除此之外，教师也可以创设形式各异的生活化的情境，以此来不断刺激学生的学习情绪。在实际教学过程中，教师需要侧重引导学生分析现实生活中热点问题，运用热门话题来激发学生的求知欲。如：在讲到关于DNA的知识时，教师则可以利用近期讨论比较激烈的埃博拉病毒为引线，创设生物知识学习情境，将新闻信息与生物理论基础进行结合，可以有效树立学生关心国家关爱社会的意识，进一步引导学生自主参与到知识探究中。
二、不断密切生物课堂与现实生活间的关系
在实际开展生物课堂教学活动时，教师可以采取联想推理的形式激发学生的生活经验，引导学生分析阅读教材给出的案例，以此来有效调动学生的学习思维，加深学生的情感体验，使学生自主感受到生物知识的奥妙，进而有效提升学生的审美能力。同时，教师在开展教学活动时，需要尽可能联系学生的现实生活，采用联想法、叙述法、问题法等多种形式来构建生活化教学情景，使学生可以结合自己的想法阐述生物知识[2]。
除此之外，教师还需要深入分析教材内容，以教材内容为切入点寻找与学生现实生活相关的生物知识，利用全新信息技术进行教学，使学生深刻感受到生物课堂教学活动不再是独立存在的个体，而是与自我现实生活具有密不可分的关系，属于生活中不可缺少的一部分。为了有效开展学生的学习视野，还需要及时挣脱教育与社会间的阻碍，将社会中多元化教学资源及家庭教育资源进行合理引入，以此来满足学生不同的学习需求。借助此种多管齐下的教育策略可以将生物知识有效渗透至现实生活中，此教学活动也更加具备吸引力，进而从根本上提升了课堂教学的质量。
三、实践操作过程中强调生活化特性
生物实验作为课堂教学活动中关键内容，教师可以利用实验操作帮助学生解析生物知识的奥秘，为学生提供操作的机会与平台，使学生自主参与知识探究活动中，以此来有效强化学生的学习能力[3]。如：教师在教学人教版高中生物人教版必修一《能量之源-光与光合作用》这一课时，教师可以利用班级内中绿植栽种的形式帮助学生理解生物知识，并提出如下问题：
（1）根据所学的化学知识可知，水和二氧化碳反应，应该生成什么产物？
（2）为什么在植物光合作用的过程中产物不是碳酸而是有机物？这说明光合作用过程中水和二氧化碳是否直接反应？
（3）光合作用的过程究竟是怎样的？其全过程分为几个阶段？各阶段的变化情况如何？
利用问题使学生借助实验操作来求解实验结论，不仅可以使学生对植物光合作用产生一个更为深刻的学习印象，也可以使学生理解运用自我所学知识也是可以解决现实问题的，有效树立学生的学习信心，提升学生学习能力的基础上，提升了课堂教学质量。
结束语
综上所述，在学生现实生活中可以接触到许多形式各异的生物现象，若是将高中生物课堂回归至生活中，不仅可以扩宽学生的学习视野，也充分激发了学生去探究生物知识的兴趣，解决了传统课堂教学活动存在的漏洞，从根本上推动了高中生物教育工作健康发展。
作者简介：张旭阳，男，黑龙江省鸡西市人，民族汉，职称：中学二级，学历：本科。
参考文献：
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【关键词】 软骨组织工程种子细胞源
多种原因造成的关节软骨病变比较常见，软骨损伤后缺乏自愈能力，软骨缺损的修复一直是临床的难题。随着细胞生物学和材料科学的迅速发展，应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能，而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键［1］。本文就有关软骨组织工程种子细胞源的优化获取、存在的问题及其解决等研究进展作一综述。
1 软骨组织工程对种子细胞源的要求
组织工程软骨的种子细胞应符合下列要求：来源丰富，取材方便；有较强的增殖传代能力；与载体材料接种后能保持增殖能力和较高的黏附率，植入受区后能保持修复组织的表型；对机体或供区损伤小，临床应用的生物安全性和无明显的免疫排斥和其他潜在危险［2］。
2 软骨组织工程的种子细胞源
2.1 自体软骨细胞
理论上讲自体软骨细胞是软骨组织工程最理想的种子细胞源，不仅功能相同，不存在免疫排斥反应，而且不需要诱导分化培养。但研究表明种子细胞浓度为(5～6)×107/ml时，形成的新生软骨形态最佳，但是自体软骨组织取材受限，软骨细胞增殖能力低，难以达到应有的细胞数量，体外培养扩增容易发生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自体软骨组织的种子细胞，体外单层培养难以获取大量的细胞以满足组织工程对种子细胞的需求。
为解决上述难题，使用生物反应器三维培养可使软骨细胞快速扩增，建立能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。生物反应器能控制pH、机械能力、营养供给条件等，为细胞的生长、分化提供最适宜的环境。根据自体软骨细胞培养所需的条件，仿生性地设计接近体内环境的软骨生物反应器，模拟了体内的细胞外基质微环境。相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数10倍甚至上100倍的细胞。可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。有利于软骨细胞的培养、扩增及表型维持。
2.2 同种异体软骨细胞
与体内其他组织相比，软骨有其独特的结构和免疫学特点。软骨无血管、淋巴管和神经，细胞包埋在由软骨基质形成的软骨囊内，可阻挡免疫细胞直接与其接触，不易被机体免疫系统攻击，软骨基质抗原性低，一般不引起或仅有轻微的免疫反应，获取种子细胞时要经过消化分离和体外培养等一系列处理，软骨细胞表面抗原可被进一步消弱。同种异体软骨来源广，易获取，一次可获取大量软骨细胞，所以同种异体软骨是值得研究的种子细胞来源［5］。应用同种异体软骨细胞作种子细胞，在具有免疫力动物体内形成同种异体工程化软骨，并用于软骨缺损修复的实验报道，未发现明显的免疫排斥反应［6］。研究表明胚胎来源的软骨细胞较成体软骨细胞引起的异体排斥反应微弱，提示在同种异体软骨组织工程中，胚胎来源的软骨细胞作为种子细胞是最佳选择［7］。对同种异体软骨细胞生物学特性和相关免疫反应问题的进一步研究，将为建立软骨组织工程种子细胞库奠定基础。
2.3 骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)
骨髓中存在具有向多种细胞系分化潜能的BMSCs。Friedenstein发现骨髓中存在少量可以贴壁繁殖的BMSCs，条件培养液诱导可分化成为软骨细胞。Cancedda等［8］对BMSCs和骨膜细胞修复兔股骨髁软骨全层缺损进行了比较，发现两者均能形成软骨和软骨下骨。
ButnariuEphrat等［9］用BMSCs复合聚合物支架，自体和异体移植修复股骨负重区软骨缺损，结果自体BMSCs早期形成类透明软骨，异体BMSCs的免疫反应导致后期纤维化和骨关节炎改变。Gao等［10］分别用成骨和成软骨条件培养液诱导培养大鼠BMSCs，复合不同材料的双层支架植入裸鼠背部皮下，术后1周检测新生组织中含有Ⅰ、Ⅱ型胶原，认为BMSCs在不同生物活性因子的作用下，结合相应的生物材料可以构建出工程化的骨软骨复合体，因此，目前认为BMSCs是一种比较理想的种子细胞源。尽管BMSCs只有较强的增殖能力和多向分化潜能性，但其数量在全骨髓中仅占1／105～1/104，并且随传代次数的增加，其软骨分化潜能逐渐降低，必须通过适当的控制条件和诱导因素，使BMSCs保持增殖并分化为软骨细胞，也有研究表明重症骨关节炎病人BMSCs的成软骨能力明显降低［11］，并且最近研究证实当BMSCs培养传代90次后细胞发生癌变，声称这符合肿瘤细胞源于干细胞的假说，因此对BMSCs应用的生物安全性必须引起高度重视和深入研究［12］。
2.4 BMSCs与软骨细胞共培养
基于BMSCs和软骨细胞均不能完全满足组织工程对种子细胞的要求，那么将2种细胞优势互补，进行共培养来优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源就成为可供选择的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛软骨细胞共培养发现，BMSCs数量比例愈高软骨细胞表达的Ⅱ型胶原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培养前的细胞比例，因此BMSCs能促进软骨细胞的增殖和基质形成，其原因是共培养系统中BMSCs分泌的活性生长因子(TGF)，通过软骨细胞介导自分泌或旁分泌上调了软骨细胞基质的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培养基培养去分化的软骨细胞，结果表明添加TGFβ能使去分化的软骨细胞重新分化，从而维持了软骨细胞的表型。在构建工程化软骨组织中，利用BMSCs增殖能力强的特点，少量软骨细胞的微环境能诱导BMSCs分化为软骨细胞，比单纯软骨细胞构建的软骨组织更为成熟，也避免了软骨细胞长期培养传代而导致的老化和去分化，并且节省了软骨细胞的用量。因此BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。
2.5 软骨膜细胞或骨膜细胞
骨膜和软骨膜生发层含未分化的间充质细胞，在低氧张力、无血供的关节腔内分化为软骨细胞、关节滑液和使用CPM是促使间充质细胞向软骨细胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Chu等［16］用异体肋软骨膜细胞和PLA支架修复兔股骨髁软骨缺损，96％的缺损6周时为软骨填充，Ⅱ型胶原比例随时间延长而升高，说明关节内环境刺激新生组织向透明软骨方向发展，黏多糖含量12个月时降低，软骨下骨厚度为正常的50％，认为异体移植的免疫反应和PLA降解产物的酸性环境影响了软骨下骨结构的形成，导致新生软骨生物力学性能下降和纤维化。
2.6 肌肉源性基质干细胞(musclederived stromal cells)
Pate等［17］使用冻融方法和地塞米松诱导培养兔肌源性基质干细胞，形成了软骨结节和含有硫酸黏多糖的细胞外基质。青年和老年人的肌细胞经诱导培养出现同样的结果［18］。Adachi等［19］用关节软骨细胞或肌源性干细胞复合II型胶原凝胶修复兔股骨髁软骨缺损区，24周后可见缺损区呈软骨样修复，优于不含细胞的I型胶原凝胶对照组，认为肌源性干细胞取材方便，细胞倍增时间短，可以作为修复软骨损伤的种子细胞源和基因治疗的靶细胞。
2.7 脂肪源性基质干细胞(adipose tissuederived stromal cells，ADSC)
为提供更多间充质细胞的自体组织，Erickson等［20］用Ⅰ型胶原酶消化人吸脂术中的皮下脂肪，经梯度密度离心获取基质干细胞，使用普通和软骨诱导培养液(含TGFβ1和地塞米松)三维培养2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫组织化学和RTPCR检测表明：软骨诱导培养液体外培养1周和植入裸鼠体内的标本均有明确的成软骨特征，而使用普通培养液的对照组则阴性，类似结果亦见于大鼠脂肪来源的干细胞［21］。源于脂肪组织的基质干细胞，因脂肪组织在体内广泛存在，取材方便，对人体造成的创伤相对较小，是目前获取种子细胞的新途径，也是研究的热点，其细胞表型与BMSCs非常相似，均表达CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLADR及Ckit表型，同时其增殖能力优于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修复软骨缺损的研究发现，在相同的实验条件下其修复效果不如BMSCs。由于该细胞为诱导性干细胞，体外培养时必须在持续诱导条件下才能分化为软骨细胞，培养难度相对较大并且其成软骨机制尚不完全清楚。如能掌握脂肪组织基质干细胞的成软骨机制和性能，在体外培养持续向软骨细胞分化，则不失为一种优秀的种子细胞源［24］。
2.8 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)
胚胎干细胞来自早期胚胎的内细胞团或尿生殖嵴，胚胎干细胞是全能干细胞，可分化为3个胚层的细胞，种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件，可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化，文献报道胚胎干细胞在BMP2和BMP4的作用下可分化为软骨细胞［25］，胚胎干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比，除具有更强的增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，因而胚胎干细胞作为种子细胞可能更为优势。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞，体外培养要求严格，自发分化难以控制，分化多具致瘤性，安全性难于把握，临床使用尚存在伦理学问题。
3 基因修饰的种子细胞
多种细胞因子有促进软骨修复的作用。通过基因重组技术，将细胞因子基因导入软骨细胞或相关细胞，使之在病损部位分泌生长因子并维持所需的浓度和时间，有效促进软骨的修复，这就是基因修饰的组织工程技术(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原与蛋白多糖的合成。绿色荧光蛋白基因转染软骨细胞可标记软骨细胞的示踪。研究表明，在骨形态发生蛋白-2和BMP-4的调控下，可在体外诱导ES细胞向软骨细胞分化，同时保留其分泌Ⅱ型胶原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP2的I型胶原海绵修复兔膝关节软骨缺损，24周时新生软骨厚度达到正常软骨的70％和潮线形成，rhBMP2组与单纯胶原海绵和旷置组间的差异只有统计学意义，但是外源性生长因子半衰期短，需较大剂量或连续给药才能发挥作用，增加了治疗成本。Baragi等［27］以腺病毒携带lacZ作为报告基因，人白介素-1受体拮抗物(hIL-1ra)cDNA作为治疗基因，用骨关节炎软骨标本体外培养软骨细胞和小软骨薄片，结果表明转染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的软骨基质变性，认为基因修饰后的软骨细胞表现出更强的生物学功能，在一定程度上弥补了自体软骨细胞供量不足的缺陷，缩短体外培养时间，更好地维持其表型。
多项研究表明以腺病毒、逆转录病毒或脂质体等作为载体，转染软骨细胞、骨膜细胞或直接注入病变部位是可行的，基因工程技术应用于组织工程领域可以使转染的细胞持续、稳定表达促进软骨修复的生长因子，但病毒类载体潜在的致畸性、免疫源性以及脂质体对种子细胞的毒性和转染率低等尚需进一步改进。
4 展望
种子细胞是构建组织工程化软骨和应用研究中的首要环节和基本要求，也是保证软骨组织工程学持续性深入研究的前提。影响优化软骨种子细胞源的因素众多，目前研究的种子细胞各具优缺点，尚没有一种细胞能够完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，今后需要开发和挖掘更多的种子细胞源，并在模拟体内的微环境中进行培养，建立种子细胞的评价系统，优化出理想的种子细胞，为软骨组织工程的研究和临床应用提供可靠保证。BMSCs相关研究和技术比较成熟，今后的研究重点是如何保证细胞能在特定的时间内定向扩增到临床治疗所需的数量，并避免致瘤性的产生。BMSCs和软骨细胞共培养可能为解决上述问题提供了一种实用的策略，但两种细胞间的相互作用机制尚需进行深入研究。目前脂肪基质细胞和胚胎干细胞的临床应用研究相对滞后，但随着科学技术的不断发展，对其成软骨机制和性能也会不断了解，优势会逐渐显现。当然，种子细胞的优化只是软骨组织工程学研究的第一步，今后还要解决细胞所需载体及细胞与载体相容性及相互作用等问题，当最终运用到临床尚需考虑免疫排斥性问题。 参考文献
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