发布时间:2023-08-01 17:07:21
序言:写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁,我们为您精选了8篇的基因治疗的策略样本,期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发,请尽情阅读。
【关键词】 拇外翻;术后骨不连;原因;治疗
DOI:10.14163/ki.11-5547/r.2015.25.015
【Abstract】 Objective To summarize causes and treatment measures for postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics. Methods There were 6 patients with postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics, 1 case among them had postoperative nonunion after first metatarsal distal osteotomy, and the other 5 cases had postoperative nonunion after first metatarsal backbone and base osteotomy. All the 6 cases received revision surgery (debridement + bone grafting internal fixation). Results After surgery, all wound had first stage healing. Follow-up for the patients lasted for 12~18 months, with the average time as 15 months. X-ray examination in the last follow-up showed complete heal in osteotomy end, without malformation or abnormal movement. Conclusion Main cause of postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics is poor local bone quality, such as osteoporosis, in fection-induced failed internal fixation, and wide range of soft tissue dissection in surgery, which will influence blood flow for supplying metatarsal bones. Treatment measures are mainly based on first metatarsal shortening degree and complicated lesion in soft tissue.
【Key words】 Hallux valgus; Postoperative nonunion; Causes; Treatment
拇外翻矫形术后骨不连的发生率为1.6%~3.0%[1, 2]。由于拇外翻患者个性之间病理的差异性和手术方式的多样性, 即使对于有经验的足踝外科医生, 手术并发症也不可避免。现回顾2010年1月~2011年6月收治的6例拇外翻矫形术后骨不连患者的临床资料, 总结骨不连发生原因及治疗策略。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 本组6例患者中男1例, 女5例;年龄21~68岁, 平均年龄44.5岁;其中1例是第一跖骨远端截骨术(Mitchell)后骨不连, 因骨质疏松导致内固定失效所致, 病程6个月。2例原术式为Ludloff截骨, 因患者较早负重造成截骨面不稳定导致骨不连, 病程9个月。1例原术式为Scarf截骨, 病程11个月。患者有2型糖尿病史20年。1例原术式为Juvara截骨, 病程9个月, 因严重骨质疏松导致内固定失效所致。1例原术式为第一跖骨基底弧形截骨, 病程10个月, 因内固定不牢靠, 截骨端分离导致骨不连。
1. 2 方法 连硬麻醉下, 患者取仰卧位, 上止血带后手术。取第一跖骨内侧做一纵行切口, 切开皮肤全层, 分辨关节囊表面内侧皮神经, 将神经拉向背侧, 术中显露并松解骨不连部位后, 彻底清创, 清除瘢痕组织, 所有硬化和坏死组织, 通过锥板撑开器恢复跖骨长度, 恢复跖骨长度后, 立即用多根克氏针横穿第一、二和三跖骨, 临时固定第一跖骨, 再考虑如何最终固定, 根据骨不连的部位及跖骨缺损程度再行决定行结构性植骨或植入同种异体松质骨颗粒, 再联合应用空心钉和钢板进行固定。
1. 3 术后处理 术后1 d, 伤口更换辅料, 术后2~3 d患足拍X线片, 术后2周拆线, 穿前足减压勉负重鞋6周, 因为血管长入植骨块的速度较慢, 直到新生骨小梁通过时才允许负重(通常需6~8周), 8周后再拍X线片, X线证实骨愈合后, 开始完全负重。
2 结果
术后切口均一期愈合, 患者均获随访, 随访时间12~18个月, 平均随访15个月, 末次随访时, X线片显示6例骨不连完全愈合。未出现畸形愈合及转移性跖骨痛, 钢板取出后跖趾关节有40~45°活动度。
3 讨论
临床认为跖骨截骨后6~8个月没有发生愈合为骨不连, 引起骨不连的确切原因尚不清楚, 但全身因素和局部因素均发挥作用, 全身性因素包括患者的代谢和营养状况, 一般健康状况和活动情况。最近有报道吸烟与骨不连有关[3], 据报道:吸烟患者皮肤和皮下组织的血氧水平较低, 从而导致伤口愈合不良。另外, 大量的动物实验证明非甾体抗炎药降低了截骨端愈合率。Vora [4]分析了26例拇外翻矫形术后骨不连患者, 发现与以下几种局部因素有关:①截骨后内固定不牢靠, 固定时间不足;②术中软组织剥离范围大, 影响了供应跖骨的血运;③局部骨质量差, 如骨质疏松;④跖骨远端截骨后外移过多, 一般大于跖骨颈的1/2;⑤感染致内固定失效;⑥术后过早负重或粗暴的功能锻炼。
第一跖骨不论何种类型截骨引起的骨不连, 在骨不连的界面可能存在缺血的骨块, 清创后, 不愈合伴随跖骨短缩会更明显。清创能使骨端出血, 促进愈合, 但清创也能导致第一跖骨进一步短缩, 增加足外侧跖骨痛的发生率。治疗策略取决于是否合并跖骨痛, 第一跖骨现有的短缩程度, 是否存在跖趾关节的骨性关节炎以及合并的软组织病变(包括瘢痕、挛缩及神经炎)。在治疗骨不连时, 要确定是否需要恢复跖骨长度进行结构性植骨, 还是单纯进行松质骨颗粒植骨以促进愈合。骨干利于固定, 而干骺端利于愈合。术中在截骨不愈合端清创后, 用锥板撑开器恢复第一跖骨长度, 但同时要确保第一跖趾关节界面不要有太大压力, 因为这样会降低拇指的活动度。注意事项:①治疗骨不连时必须考虑患者的全身和局部因素处理, 治疗骨不连前患者应有良好的代谢和营养状况, 鼓励患者戒烟, 活动水平可根据不同需要而改变;②在制定治疗计划时必须考虑骨不连周围软组织的状况, 不能伸展的瘢痕组织, 常可导致皮肤坏死;③骨不连的治疗要求在恢复第一跖骨长度的前提下, 充分植骨和坚强固定;④植骨时骨的来源很多, 有自体骨、异体骨、人工合成骨替代物等。由于自体骨具有骨传导(基质)和骨诱导(蛋白质)的特性, 同时又含有骨原细胞, 是一种理想的植骨材料[5], 自体骨松质通常取自髂骨;⑤治疗骨不连的内固定应提供足够稳定的固定, 但不要过于坚强;⑥建议骨不连患者在治疗过程中尽可能避免应用非甾体类抗炎药和激素;⑥值得注意的是骨不愈合的治疗目的不仅仅是促进愈合, 还要注意纠正跖骨的非正常位置避免畸形愈合。
参考文献
[1] Roukis TS, Meusnier T, Augoyard M. Nonunion rate of first metatarsalphalangeal joint arthrodesis with crossed titanium flexible intramedullary nails and a dorsal static staple with immediate weight bearing. J Foot Ankle Surg, 2012, 51(2):191-194.
[2] Mankovecky MR, Prissel MA, Ts R. Incidence of nonunion of first metatarsal-phalangeal joint arthrodesis with autogenous iliac crest bone graft after failed Keller-Brandes arthroplasty: a systematic review. J Foot Ankle Surg, 2013, 52(1):53-55.
[3] Adam SP, Choung SC, Yang G, et al. Outcomes after scarf osteotomy for treatment ofhallux valgus deformity. Clinical Orthopaedics & Related Research, 2011, 469(3):854-859.
[4] Vora AM. First metatarsal osteotomy nonunion and malunion. Foot Ankle Clin, 2005, 10(1):35-54.
关键词: 颅内肿瘤;胶质瘤;基因治疗;靶向治疗;综述文献
1 胶质瘤基因治疗的分子策略
当前胶质瘤基因治疗的分子策略包括以下几点:细胞周期调节基因及凋亡基因;自杀基因;免疫调节基因;抑癌基因;血管生成抑制基因;PKR途径。以上各策略可相互联系,并相互联合。
1.1 细胞周期调节基因及凋亡基因
P53与E2F1作为2种非常重要的抑癌基因, 维持基因组的稳定, 激活细胞凋亡。两者所不同的是P53基因可调节细胞周期,其变异能明显降低恶性脑胶质瘤对化疗的敏感性, P53基因在脑胶质瘤的高突变率为脑胶质瘤的靶向性基因治疗提供了重要的基础[2]。与P53基因不同的是,E2F1是直接调控细胞周期[3],其不良反应是它对正常细胞的毒性和潜在的致瘤性。
1.2 自杀基因
自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位。自杀基因(suicide gene)疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞,此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物,以达到杀死肿瘤细胞为目的。不少学者[4]通过研究发现, 只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养,不仅转染的癌细胞被杀灭,二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡,即“旁观者效应”。该效应可使仅部分肿瘤细胞转染了自杀基因的整个肿瘤均受到经自杀基因转化了的抗癌“药”的攻击而全部消退。至于旁观者效应发生的机理, 多数研究表明它与细胞间的缝隙连接和免疫效应细胞在肿瘤病灶中的浸润有关。(1)细胞毒性产物通过细胞间的缝隙连接进入邻近细胞。(2)被破坏的细胞释放毒性物质和凋亡小体进入周围微环境, 并被邻近细胞摄取。(3)自杀基因杀死的细胞释放细胞因子, 进一步吸引免疫细胞进入肿瘤, 介导抗肿瘤免疫反应。(4)导致血管内皮细胞死亡, 引起肿瘤细胞缺血坏死。在肿瘤细胞中旁观者效应的物质基础一缝隙连接数量较正常细胞缺乏, 利用环腺昔酸(cAMP)可以诱导缝隙连接形成或导入缝隙连接的亚单位连接素43(connexin 43)的cDNA, 从而大大加强旁观者效应[5]。临床上,意大利的Colombo等[5]用结合的IL2/HSV.tk基因疗法治疗再生的多形恶性胶质细胞瘤,他们向瘤内注射转录病毒载体引导细胞(PVPC),然后静脉注射GCV,结果显示,实验组的患者的存活率提高。
1.3 免疫调节基因
免疫调节基因主要是通过基因重组技术来增强机体的抗肿瘤免疫功能达到治疗肿瘤的目的,这主要包括3个方面:(1)肿瘤抗原提呈功能的加强,如从临床患者的血液和手术切除标本中获取自身抗原提呈细胞,在体外经GMCSF等细胞因子作用下扩增,体外表达肿瘤抗原的DNA或mRNA,然后回输入患者体内;(2)细胞因子基因转导肿瘤细胞;如将一基因体外转导脑胶质瘤细胞, 体外培养扩增后接种于病人自身皮下, 可发现肿瘤病灶明显缩小, 颅内胶质瘤明显坏死。(3)B7共刺激分子基因导入肿瘤细胞[7]。Mukhecjee等[8]在靶向T11结构的一种蛋白质(aprotein known as T11 target structure,T11 )注射N乙基·N·亚硝基脲( ENU)诱导的免疫抑制大鼠后,观察外周和神经系统的改变以及脾,脑浸润淋巴细胞的细胞毒性活性变化,用流式细胞仪测定肿瘤细胞和小神经胶质细胞含量,发现T11TS不仅增加了凋亡细胞的数目,同时降低了分裂细胞数目,而脾和脑浸润细胞的细胞毒性也有显著增加。数据证实了TILTS对实验脑肿瘤的特殊细胞凋亡作用。
1.4 抑癌基因治疗
抑癌基因亦称为抗癌基因,是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆出20余种抑癌基因,而D53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,不少研究也证明肿瘤的生成会伴随p53的缺失。Michiue等[8]使用了基因突变的p53蛋白,将羧基末端的多赖氨酸残基用精氨酸取代的产物,转导人胶质瘤细胞,由于存在对Mdm2(鼠双微基因)介导的遍蛋白化耐受性,这种蛋白具有较强的转导调节活性,同时抑制胶质瘤细胞的增殖,表现了其在P53基因治疗方面的应用潜力。
1.5 血管生成抑制基因
固体肿瘤的生长及增殖,需要新生血管提供足够的血运。而胶质瘤自身能产生一些血管生长因子,促进血管内皮细胞的分裂增殖。因此抑制肿瘤血管形成成为冶疗肿瘤的另一策略。早在1971年Fdkamn首先发现肿瘤血管生成因子,并由此提出了对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预,经抗血管生成途径治疗肿瘤的新方法。它的优势是:(1)抗肿瘤血管生成治疗不是直接攻击肿瘤细胞, 不会产生放疗和化疗所造成的肿瘤细胞遗传性状的不稳定和治疗后耐药性。(2)由于肿瘤部位的血管内皮细胞比肿瘤细胞遗传性状稳定, 而正常血管内皮细胞处于不分裂的状态, 故抗肿瘤血管生成治疗对其影响不大。(3)另外由于内皮细胞本身就浸泡在血液中, 药物到达血管比到达肿瘤要容易得多。这说明抗肿瘤血管生成治疗与传统治疗相比有内在的优势, 已成为一种重要辅助治疗方式。胶质瘤作为一种实体瘤, 抗肿瘤血管生成治疗也具有重要价值。
1.6 PKR途径
活化性双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一种生长抑制性蛋白, 通常它能使病毒感染的细胞活化, 并诱导其死亡[10]。
2 靶向性基因治疗研究
【关键词】 癌症;基因治疗;优势
癌症是危害人类健康的第一大杀手。虽然目前医疗技术不断进步,科技含量的比重越来越大,抗癌的手段越来越多,但还是不能完全消除癌症的威胁,很多癌症患者因保守癌症的摧残和折磨而痛不欲生。随着基因工程的不断崛起,用以病毒为载体的基因治疗方法来对付癌症,已成为国内外医学癌症专家的研究方向。
1 癌瘤的形成机理
癌细胞繁殖多了,便会结成癌瘤。癌细胞海辉扩散开来,在身体的各处生产癌瘤。它们行为放肆,无时无刻不在消耗身体的能量和营养物质,毫无忌惮地浪费身体的资源。打个比方来讲,一个葡萄糖分子,有正常细胞来利用,可以产生38个ATP,而如果由癌细胞来用,只产生2个ATP,然后便将其余的能量分子全部当做垃圾丢掉了。大部分的癌症病人,到了晚期,身体的营养都被癌细胞消耗掉了,因此看起来骨瘦如柴,毫无生气。
2 病毒杀掉癌细胞的原理
所谓以病毒为载体的基因治疗,也就是我们来合成病毒,让其钻进癌细胞,并在癌细胞内部生活和繁殖,毫不留情地消耗掉癌细胞的生存资源,使得癌细胞“死掉”,从而起到治疗癌症的作用。简单来说,就是“以其癌之道反之其癌之身”。
3 癌症基因治疗中常用的病毒载体
癌症的基因治疗是根据不同癌症的发病机制,通过合适的载体将肿瘤抑制 基因、炎症因子基因或小RNA等治疗基因导入到肿瘤细胞中。理想的载体是安全性高、能有效将足量治疗基因针对性地导入靶细胞中(包括目标组织内的靶细 胞),并能在其中持续特定时间表达治疗剂量的分子。
目前,癌症基因治疗相关的载体系统仍处于研发阶段,常用载体主要有两类:病毒载体和非病毒载体。非病毒载体主要包括直接注射或借助物理化学手段,如电转化、超声波、脂质体等,将的DNA或RNA直接导入病灶细胞中,缺点是转入效率低,且在体内不能长久表达。病毒是一类由核酸(DNA或RNA)和蛋白质组成的寄生于活细胞中的微生物,由于其高感染性,经改装后病毒载体可将外 源基因高效转入宿主细胞。病毒载体依据其在宿主细胞中增殖与否,分为复制型与非复制型病毒载体。出于安全考虑,非复制型病毒载体在近20年一直广泛应 用于疫苗及基因治疗研究,腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒。是目前 最常用于基因治疗的病毒载体.
近几年,癌症基因治疗载体已开始逐渐由非复制型病毒载体向复制型载体 过渡。复制型载体的特点是病毒能够选择性地在目标癌细胞中复制增殖,介导细胞裂解,释放出的病毒继而感染肿瘤实体中的邻近细胞,从而形成一个在瘤体组织中不断感染—增殖—裂解癌细胞的循环。非复制型病毒载体的一个明显缺陷是无法感染肿瘤实体内部大部分细胞,因此不能最大限度地控制癌细胞的增殖及 转移,而复制型病毒载体则可克服这种缺陷。复制型肿瘤裂解载体的效果目前已在临床前试验中得到广泛验证,且已进入临床试验阶段。
4 结论与展望
癌症是由多种因素导致的疾病,发病机制复杂,单一疗法很难治愈,未来的 肿瘤治疗必定是多种策略联合使用,包括更灵敏的诊断试剂、癌症疫苗,以及继 传统疗法之后新兴的基因疗法、免疫疗法等多种生物疗法。作为治疗癌症非常有潜力的一种策 略,基因治疗通过最大限度地加强病毒载体对肿瘤细胞的特异性,以及尽可能地减少对正常细胞的副作用。而将为癌症患者提供比传统疗法更有效 的治疗效果和安全性。
小分子和蛋白类药物的诸多缺点,限制了其在实际治疗中的应用。而将溶瘤腺病毒应用于靶向肿瘤干细胞的癌症治疗非常适合。但在实际应用中,仍有一些需要解决的问题。首先是如何进一步提高腺病毒对肿瘤干细胞的靶向性。我们可以通过改造病毒外壳蛋白来达到此目的。外壳纤维蛋白(fiber)头部的HI环决定腺病毒靶向细胞的类别,其内部序列的变化会影响fiber与靶细胞表面受体的相互识别,从而改变病毒的靶向性。Reynolds等[1]将RGD三肽插入HI环区内,改造后5的型腺病毒可以转染不表达柯萨奇—腺病毒受体(coxsackie—adenovirusreceptor,CAR)的细胞,改变了其原先的靶向性。若对fiber的HI环的氨基酸残基序列进行改造,使之拥有与肿瘤干细胞表面特异受体的强结合力,可以使腺病毒获得对肿瘤干细胞的靶向性,提高感染率。
参考文献
[1]Reynolds P,Dmitriev I,Curiel D.Insertion of an RGD motif into the HI loop of adenovirus fiber protein laters the distribution of transgene expression of the systemically administered vector.Gene Ther,1999,6(7):1336-1339.
关键词:肺癌;自杀基因;端粒酶催化亚单位;靶向性表达
中图分类号:R734.2 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2007)03-0273-06
人端粒酶催化亚单位(human telomerasecatalytic subunit,hTERT)是端粒酶的重要组成部分,其活性是端粒酶活性的决定性因素,几乎所有分化成熟的正常体细胞均无端粒酶表达,而85%以上的肿瘤细胞中有高水平的端粒酶活性,因此,hTERT基因的表达也具有高度的肿瘤特异性,对端粒酶的深入研究结果显示,hTERT基因表达的调节是多水平的,其中hTERT启动子在转录水平的调控是最主要的调节机制,因此,作为转录调控元件的hTERT基因启动子的转录活性也应该具有高度肿瘤特异性,基于此,如果用hTERT启动子作为基因转录调控元件,来调控治疗基因在肿瘤细胞异性表达,有可能实现肿瘤基因治疗的靶向性,这方面的初步研究结果展示了令人鼓舞的前景,本研究采用基因工程方法构建了hTERT启动子调控自杀基因HSV-TK的肿瘤细胞特异性表达载体,以探讨hTERT启动子作为肺癌靶向性基因治疗中转录调控元件的可能性。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞
人肺腺癌细胞株A549和人胚肺成纤维细胞株MRC-5分别引自中国医学科学院上海细胞库和中国典型培养物保藏中心。
1.1.2 质粒
含SV40启动子和增强子的荧光素酶报告质粒pGL3-Control,由四川大学华西医院感染性疾病中心唐红教授惠赠:含TK基因的质粒PCDNA3-TK由四川大学华西医院车国卫博士惠赠,含1083bp的hTERT启动子的质粒pGL3-hTp由本课题组在前一阶段研究中构建。
1.1.3 主要试剂
限制性内切酶HindⅢ、Xba I、PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒及DNA连接试剂盒DNA LigationKit Ver.2.1均为大连宝生物工程有限公司产品:脂质体Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol以及RPMI 1640、DMEM培养基均为Invitrogen公司产品;TK基因PCR引物由北京赛百盛公司合成;细胞基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及PCR反应产物回收纯化试剂盒均购自北京赛百盛公司。
1.2 实验方法
1.2.1 PCE扩增TK基因
以质粒PCDNA3-TK为模板扩增TK基因,TK基因上游引物序列为:5'CCCAAG CTTM CGC GTATGG cTr CGT AC 3',下游引物序列为:5'CCCTCT AGA CCG GTA TrG TCT CCT TC 3',上下游引物5′端分别带有HindⅢ、Xba I的酶切位点(用下划线标示);PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环;72℃7min,反应结束后,取PCR产物6μL电泳,并送大连宝生物工程有限公司作DNA测序。
1.2.2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的构建及鉴定。
质粒pGL3-hTp和pGL3-control作HindⅢ/XbaI双酶切,用胶回收方法回收酶切产物中去除lu-ciferase基因片段的载体片段(分别约4.2kb和3.6Lb),并与PCR扩增的TK基因的HindⅢ/XbaI双酶切产物作连接反应(图1,2);反应液转化大肠杆菌JM-109,用氨苄青霉素筛选阳性菌落,扩增,提取质粒,采用单酶切(HindⅢ)、双酶切(HindⅢ/XbaI)和PCR方法鉴定。
1.2.3 转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTD-TK的细胞A549和MRC-5中TK基因表达的检测
对数生长期的A549和MRC-5细胞,用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pGL3-SV40-TK(阳性对照组)、pGL3-hTp-TK(实验组)和pGL3-hTp(阴性对照组),转染方法按照Lipofectamine 2000操作说明进行,72h后,提取DNA和RNA,并用PCR和R7-PCR方法检测各转染细胞中TK基因的存在和表达情况。
2 结果
2.1 TK基因的PCR产物电泳鉴定及DNA测序结果
电泳显示,TK基因长度约1.1kb(图3);DNA测序结果与GenBank中TK基因序列完全一致(Ac- cession NP_044624),长度为1131bp(图4)。
2.2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的鉴定
HindⅢ单酶切显示,pGL3-hTp-TK长度为5.4kb,pGL3-SV40-TK长度为4.8kb;两种质粒HindⅢ/Xba I双酶切均在1.1kb位置出现DNA条带(TK基因),以两种重组质粒为模板,PCR均扩增出厂K基因片段(图5和图6)。
2.3 转染细胞中rx基因表达的检测结果
转染了质粒pGL3-h7p-TK和pGL3-SV40-TK的细胞株A549和MRC-5基因组DNA,PCR均扩增出TK基因(图7),说明pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK均成功转入A549和MRC-5细胞:TK-PCR实验结果显示:转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的细胞中,A549有TK mRNA表达,MRC-5无TK mRNA表达;转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞均无TKmRNA表达(图8,9)。
3 讨论
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一,也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一,自杀基因是来源于病毒或细菌的一些药物酶基因,如果将他们导人肿瘤细胞,
其表达产物可以将某些无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性药物,影响肿瘤细胞的DNA合成,导致细胞损伤,单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因是最具代表性的自杀基因,HSV-TK可以使核苷类似物如更昔洛韦,阿昔洛韦等磷酸化,生成环腺苷一磷酸,后者可以被细胞自身的激酶进一步磷酸化成为三磷酸盐,这些三磷酸盐通过DNA多聚酶α加入到DNA复制过程中,可导致DAN复制链终止及诱导DNA单链断裂,在体外实验和动物模型研究中,HSV-TK/GCV系统对多种肿瘤都显示了令人鼓舞的治疗效果;HSV-TK/GCV系统也是目前少数进行了Ⅲ期临床试验的肿瘤基因治疗方案之一,然而,由于HSV-TK/GCV的治疗作用缺乏肿瘤特异性,可能对正常细胞也具有损伤作用,Herraiz等的动物实验显示,HSV-TK/CCV有导致严重肝损害的可能,实现基因治疗作用的肿瘤细胞靶向性,对提高自杀基因治疗方法安全性及其临床应用具重要意义。
关键词: 辩论 基因工程 教学设计
1.教学目标设计
1.1学习需要分析
通过本节“基因治疗”的学习可以加深理解基因工程的一般过程。需要进一步给学生渗透“STS”的教育理念,理解科学、技术、社会的相互关系,树立科学的世界观和价值观。学生通过基因工程正负两方面的影响,形成哲学中的“矛盾”思想,通过对“转基因生物的安全性问题”的辩论,进一步提高生物科学素养。
1.2教学内容分析
“基因工程的应用”是建立在第一节“基因工程概述”基础上的。基因工程这种现代的生物科技是一把双刃剑,本节内容是从基因工程的有利应用和可能的负面影响两个方面阐述。本节内容的安排有承上启下的作用。
1.3教学对象分析
学生已经具备遗传学基础,对基因工程的概念初步了解,初步掌握基因工程的常用工具和一般过程。课前已经组织学生从报纸、杂志、网络等媒体收集基因工程研究热点、发展趋势和应用前景等。学生开阔了视野,增强了科技意识,对于“长期食用转基因豆油是否有利于身体健康”这一问题分为正反两方。先收集资料,课堂上再进行辩论,两方学生各选出辩手:一辩、二辩、三辩、四辩。
1.4教学目标编制
知识目标:举例说出基因工程在农业、医疗、环保等领域的应用;举例说出生物武器的危害;收集“转基因生物的安全性问题”相关资料。
能力目标:形成收集信息、分析和处理信息的能力。
情感与价值观目标:关注基因工程的发展,认同基因工程的应用促进生产力提高;关注转基因生物的安全性问题,培养科技意识。
1.5教学重点的把握、教学难点的预测
本单元教学重点:基因工程在农业、医药、环保等领域的应用。
预测教学难点:学生形成收集信息、分析和处理信息的能力。
2.教学策略设计
2.1教学准备
课前准备:导学案、多媒体课件、辩手准备的辩论稿件。
课时安排:一课时。
2.2教学过程
2.2.1导入新课,激发兴趣。展示“转基因鸡”耕地的图片,投影:恐龙鸡是利用一种“逆向基因工程”技术,复苏现代家鸡体内沉睡的“恐龙基因”,从而让鸡“退化”成一半像恐龙、一半像鸡的恐龙鸡。学生小组讨论:理论上如何创造出“恐龙鸡”,几个组代表发言,说出本组讨论结果。设计意图:激发学生的学习兴趣,提高学生的想象力、创造力。
2.2.2基因工程的应用。教师组织学生独立完成前置测评题,在学生做完题之后,公布答案,安排学生自主批改。教师在统计正误的基础上,对学生的认知基础误差予以矫正,巩固上节课所学的重点内容。引入本节所学新课:(1)举例说出动物基因工程的应用。(2)能举例说出植物基因工程的应用。(3)什么是基因诊断?什么是基因治疗?(4)基因治疗ADA基因缺陷症的过程包括哪些主要步骤?组织学生进行学习小组讨论:“如何治疗镰刀形细胞贫血症?”投影学生讨论后的书面结果;组织学生进行班级交流,通过师生点评的方式,进一步完善学生的学习结果。学生活动:阅读课本21、22、23页的图及相关文字,举例说出动物、植物基因工程的应用,明确基因诊断、基因治疗的定义。阅读课本24页的图1至12及相关文字,说出ADA基因缺陷症基因治疗过程。学习小组内先“兵”教“兵”,各组掌握不太好的学生展示书面结果,组间同学评价。设计意图:通过基因治疗过程的学习,加深理解基因工程的操作过程。学生能模仿“基因治疗ADA基因缺陷症的过程”,说出治疗镰刀形细胞贫血症的过程,给学生渗透“STS”的教育理念,理解科学、技术、社会的相互关系。
2.2.3转基因生物的安全性问题。投影转基因大豆生产的食用油、非转基因大豆生产的食用油。组织辩论赛:长期食用转基因豆油是否有利于身体健康?评委成员:四位高三生物教师和两位语文老师。正方:有利于身体健康。反方:不利于身体健康。组织学生依次进行立论阶段、驳立论阶段、质辩环节、自由辩论、总结陈词。八位辩论赛手进行比赛,其余学生分为正反两方就座。辩手遇到太难问题时,可以求助赛手之外的同学。设计意图:学生养成收集信息、分析和处理信息的能力。增强学生总结能力、语言组织能力、组内协调、合作能力。小辩论赛结束后,生物教师和语文教师分别从生物学角度和辩论角度给予点评。
2.2.4生物武器的危害。播放视频:2014年7月30日埃博拉疫情严峻已致死672人。(1)举例说出:一些致病微生物的危害与控制。(2)什么是人类基因组计划?(3)能否研制出针对特定种群(人)的生物武器,为什么?学生先组内成员互教,后小组代表发言,其他组代表评价。设计意图:关注时政,了解国际大事。增强人道主义教育,明确世卫组织救援的意义。通过小组学习过程中的合作与交往,培养学生的协作意识与交往态度。
2.2.5教学评价。先安排学生独立完成课本28页的“评价指南”;然后展示答案,组织学生互改,统计正误,分析误差的原因,进行针对性矫正。根据各学习小组的积分,评选出冠军组、亚军组。设计意图:检测学生的学习情况,增强学生的集体主义荣誉感。培养学生撰写综述的能力。
【关键词】 治疗性疫苗;免疫应答;研究进展
传统意义上的疫苗是在健康人体中激活特异性免疫应答, 促使机体产生特异性抗体及细胞毒性T淋巴细胞, 从而达到预防疾病的发生。但是, 传统疫苗重在预防, 而对已发病的个体则不能诱生免疫性应答, 也无法抵御疾病的发生。
治疗性疫苗是近几年建立并发展起来的新的免疫治疗概念, 它通过改善及增强对疫苗靶抗原的摄入、表达、处理、呈递, 激活免疫应答, 唤起机体对靶抗原的免疫应答能力, 达到诱导已患病个体的特异性免疫应答, 从而实现清除病原体或异常细胞, 治愈疾病的作用[1]。目前, 治疗性疫苗在临床已得到越来越多的关注。本文就治疗性疫苗的研究进展情况进行简要探讨。
1 治疗性疫苗的种类
目前, 正在研究的治疗性疫苗主要有蛋白质复合重构治疗性疫苗、基因治疗性疫苗及细胞治疗性疫苗等三种。
蛋白质复合重构治疗性疫苗是从三个方面开展对必需的靶抗原的结构或组合, 从而达到重新唤起患者功能性免疫应答的目的。一为在蛋白质水平上进行修饰, 二为在结构或构型上加以改造, 三从组合上以多蛋白的复合及多肽偶联等形式加以改造。
基因治疗性疫苗是通过将编码抗原质粒直接导入机体组织中, 在注射局部表达这种抗原, 达到诱生抗原特异性体液及细胞免疫应答。基因治疗性疫苗是从体内表达抗原, 并通过在空间构象, 在抗原性上更接近于天然抗原;基因治疗性疫苗可模拟体内感染过程及天然抗原的呈递过程;可诱生抗体特异性免疫应答;便于操作及改造, 且生产周期短, 具有一定的经济实用性[2]。
细胞治疗性疫苗是肿瘤治疗性疫苗设计的热点, 如肿瘤细胞和树突状细胞疫苗。肿瘤细胞中含有广谱肿瘤抗原, 但目前仍缺乏协同刺激分子, 以识别并激活免疫细胞, 如果通过使各种辅助分子修饰肿瘤细胞或树状细胞, 可以有效增强细胞治疗性疫苗的免疫原性, 从而达到治疗的目的。
2 治疗性疫苗的研究现状及进展
目前, 治疗性疫苗已在艾滋病、慢性乙型肝炎、肿瘤等多种疾病领域取得了较大的进展, 世界上首个肿瘤治疗性疫苗已在古巴研制成功, 并于2008年上市;我国拥有自主知识产权的乙肝免疫复合物型治疗性疫苗已进入Ⅲ期临床研究。
2. 1 肿瘤治疗性疫苗 肿瘤治疗性疫苗通过激发患者的自身免疫性反应从而发挥其抗肿瘤的作用, 具有特异性强、毒性低、可产生持续疗效等作用。
淋巴瘤治疗性疫苗自第Ⅰ期临床观察以来, 已有20余年的时间, 但其Ⅲ期观察结果仍没有取得令人满意的临床疗效, 目前尚在研究, 并不断改善中, 目前正通过抗原传递的优化、展现, 加强抗肿瘤T细胞功能等策略改善其临床疗效。宫颈癌的发生是由于机体感染了人瘤病毒(HPV), 其治疗性疫苗主要有多肽疫苗、树突状细胞疫苗、重组蛋白疫苗、重组牛痘病毒疫苗等, 部分疫苗已处于第Ⅰ期、第Ⅱ期临床观察中。上皮生长因子(EGF)及其受体已成为抗肿瘤的新靶标, 此外, 它还参与了恶性肿瘤的细胞生理。EGF治疗性疫苗的研究在古巴取得了较大的进展, 且已通过Ⅲ期临床观察, 并在延长晚期现癌患者的生存期, 减轻副反应等方面取得了较好的效果。
在肿瘤治疗性疫苗的研究中, 采用抗原特异性免疫疗法及针对DR5抗体进行治疗的方式治疗晚期癌症、溶瘤病毒疗法等也在研究中。
2. 2 病毒性疾病治疗性疫苗 近几年, 在慢性感染性疾病, 如乙型肝炎、丙型肝炎的治疗性疫苗也取得了较大的突破。乙型肝炎免疫治疗, 尤其是可消除免疫耐受, 加强特异性应答的治疗性疫苗研究在临床上取得了较大的进展;近几年, 我国丙型肝炎的治疗性疫苗研究中, 一种通过采用多表位嵌合抗原的方法, 获得了具有高覆盖面的多细胞免疫抗原, 可以有效杀灭感染丙型肝炎病毒的细胞, 这也是目前处于国际同类产品前列的研究;还有一种新的载体HCV治疗性疫苗, 它是基于高度减毒的痘病毒株MVA的T细胞诱导的治疗性疫苗, 目前正在观察不同免疫程度的效果。
2. 3 AIDS治疗性疫苗 目前, 挪威科学家正在研究HIVp24样多肽治疗性疫苗, 其通过活化皮肤树突状细胞而诱导免疫反应;除此之外, 科学家还尝试采用重叠的HIV多肽融合表达, 运用树突状细胞的免疫疗法及一些新药物结合有维生素D3的巨噬细胞活化因素。
综上所述, 治疗性疫苗的研究历史还比较短, 仍有许多问题正在不断探索当中, 相信随着研究的不断深入, 具有潜在经济及社会效益的治疗性疫苗的研发成功, 将会使越来越多的人们受益。
参考文献
[1] 游丹, 刘舒媛, 杨昭庆. 治疗性疫苗应用于慢性/感染性疾病治疗的研究.中国医药科学, 2012, 2(9):151-155.
1.锁核酸的化学结构与理化性质
1.1化学结构 锁核酸(10cked nucleic acid,LNA)也称桥核酸,是一种化学结构较特殊的双环状核苷酸衍生物,其分子结构中含有一个或多个2’-0.4’-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2’-0位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,形似锁状或桥状,这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架的局部结构的稳定性。LNA的特殊构象能够导致核酸骨干的预组装,在某种程度上增加碱基堆积力,有利于双链形成。
1.2理化性质 由于LNA化学结构的特殊构象,其理化性质比其他寡核苷酸具有更突出的势:①提高与补序列的杂交高亲和性:因为LNA碱基与DNA、RNA的磷酸盐骨架相同,LNA碱基与互补序列杂交时不但具有更高亲和力,而且这种相同的磷酸盐骨架能使互补序列被LNA容易识别,从而形成高亲和力的杂交物。②增加互补双链的热稳定性:LNA单体增加到寡核苷酸链中时,其解链温度(Tm)可明显提高,在LNA与DNA形成的杂交双链中,Tm可提高2℃-6℃,在LNA与RNA形成的杂交双链中,Tm可提高3℃-9℃,可见与互补双链的热稳定性明显增加。③改善抗核酸酶切割能力:血液中siRNA不稳定,极易被大量的核糖核酸酶迅速分解,在siRNA 3’末端被LNA单体修饰后,siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明显提高。④LNA的无毒性:注射反义LNA后,通过检测小鼠血清肝肾功能生化指标和病理切片HE染色,未发现有明显变化。⑤LNA与DNA或RNA结合时,错配辨别力更强。⑥LNA水溶性好,自由出人细胞,易被机体吸收。正是因为LNA所具有的这些优势,近年来不管是在基因诊断还是基因治疗中,LNA成了学者的研究热点。
2.LNA在抗病毒诊断中的应用
2.1乙型肝炎病毒(HBV)检测 在治疗慢性乙型肝炎时,核苷类似物如拉米夫定(LAM)、替比夫定、阿德福韦(ADV)等被长期应用于抗乙肝病毒(Hepatitis B Virus.HBV)治疗并一定程度上抑制了病毒的复制。但是长期使用这些抗病毒药物可使病毒基因发生变异,产生耐药,最终引起无效治疗和影响后期的康复。因此,测定先存或新形成的HBV抵抗菌株在临床治疗中对抗病毒治疗方法选择有着重要意义。目前检测耐药HBV一般由直接测序法完成,但是这种方法耗时,更重要的是无法同时检测混在同一样品中野生型和变异型的种群,因此不适合常规的临床应用。普通PCR扩增病毒DNA的种群测序法敏感性较低,当新形成的变异株数量较少或是中止治疗后变异株降低时难以鉴别。其他的方法比如线性探针分析法,敏感性虽然比普通PCR扩增病毒DNA的种群测序法增加5%-10%,但是变异株的数量常常在它的检测最低水平以下。建立一种灵敏、特异、准确、快速、方便的检测方法对于慢性乙型肝炎感染者抗病毒治疗中耐药性的确定和监测具有重要意义。有研究者构建聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针.并用这两种方法与直接测序法检测拉米夫定药物治疗的乙肝患者血清HBV,实验结果显示,PCR-RFLP与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法可以检测野生型YMDD和它的变异型YIDD和YVDD,但Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法鉴定耗时少,更敏感。Wang Q等用同样的方法检测15例单纯HBsAg(+)样本,结果有4例HBsAg(+)样本未能被普通TaqMan探针检测出阳性,而使用LNA-TaqMan探针法检测全为阳性。Sun z等建立TaqMan-LNA探针多重实时PCR(multiplex realtime PCR)方法鉴别野生型和突变型菌株。研究发现这种灵敏的方法可以定量10拷贝的HBV,能检测10拷贝野生型HBV中存在低至1%的突变型,而且分析30例HbsAg(+)血清样品只需要3.5小时。用等位基因特异性锁核酸实时荧光定量PCR(RT-AS-LNA-q PCR)方法.通过序列匹配标准对变异型和野生型HBV定量,实验中能准确检测占总菌数水平0.1%或以下的17种不同的核苷酸变异且进行基因分型。Zeng Y等用同样的方法检测野生型、突变型标准质粒时,证实了该方法线性范围宽和检测下限低,而且准确度高。
2.2丙型肝炎病毒(HCV)检测 HCV病毒载量的测定是慢性丙型肝炎治疗管理必不可少的一部分。常用的血清和血浆的HCV RNA定量非常耗时且试剂用量大,另外,一些存留在细胞内如外周单个核细胞(PBMC)、冷沉淀剂、吸附在红细胞或血小板的病毒RNA无法检测。因此,定量血清或血浆HCVRNA往往低于总的循环病毒载量。虽然检测存留在PBMC和全血的HCV RNA可为干扰素治疗结束后预测病毒复发,然而定量分析PBMC病毒动力学只能提供微小的预测信息,而且PBMC分离、计数、洗涤程序也较为烦琐,因此,或许全血定量HCVRNA可以作为最佳选择。但是,尚未有研究证实是否用全血定量HCV RNA比血浆或者血清具有更高的诊断敏感性。Bruns T构建LNA合成的核苷酸衍生物2’-0-甲基RNA(2’-ome-RNA)形成稳定的复合物而更能抵抗核酸酶的降解,因此LNA修饰的寡核苷酸能提高RNA的提取率。从222份临床血浆样本,82份用LNA介导的捕获方法提取HCV RNA,实时反转录PCR(real-time reverse transcription-PCR)定量,结果与试剂盒H AmpliPrep/TaqMan(CAP/CTM)HCV测试比较,这个实验的分析敏感性为9IU/10微升样品,线性范围为500-5×10 IU/ml,在血浆准确测试10个HCV亚型:血浆和全血样品检测结果是相等的(决定系数R2=0.943)和在全血异性为100%(n=20);敏感性在血浆浓度为95%检测极限时全血样品为100%(n=141);10微升全血定量结果与HCV血浆测试结果具有相关线性(R2=0.919;n=140)。目前检测人类肝组织HCV的方法主要有免疫组织化学、原位杂交(ISH)、原位RT-PCR,但是免疫组织化学和ISH重复性较差,原位RT-PCR虽然敏感性好,但伴随着较高的假阳性率。为了寻找可靠诊断的组织化学技术检测肝组织HCV,设计LNA探针ISH技术和生物素释放信号扩增系统(biotin-free catalyzed signal amplification sys-tern,CSAII)检测中嵌合体小鼠和丙肝患者肝组织HCV RNA,结果显示阳性率分别为100%(13/13)和82%(9/11),在慢性乙肝损伤、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原发性肝癌中HCV RNA均是阴性。证明了LNA探针ISH技术简单可靠,适用于常规细针活检检测丙肝患者肝脏中HCV RNA。
2.3HIV检测 精确检测血液中HIV DNA和RNA,o论诊断是否HIV感染,还是评估HIV病人治疗后病毒载量、病毒复制的治疗效果都起到重要作用。但在广泛使用抗病毒治疗的环境下,HIV-1由于基因变异产生了药物抵抗,但其机制非常复杂.当产生药物抵抗时需要改变治疗方案。HIV的单核苷酸基因多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)给各种传统的检测方法检测提出了难题,一方面HIV-1 M组HIV-1亚型遗传多样性,无法与多种变异型特异性结合,目前大多数的荧光定量PCR只适合定量HIV-1 B亚型;另一方面为使探针退火温度达到最佳,传统的Taqman探针包括25至35个核苷酸。由于HIV-1自然的异质性,很难在200个碱基对中找到三个保守区(两个为引物一个为内部探针同源序列)包括所有或大部分HIV-1 M组亚型,这造成了检测时灵敏性降低。因此需要一种灵敏、高效的实验方法监测HIV-1型的治疗。许多学者在各种方法的基础上用LNA修饰改良而使检测的敏感性和特异性上升。因为构建的LNA Taqman探针比普通的Taqman探针更短,与HIV-1亚型保守序列杂交的靶标也相应变短.可以有效克服传统探针的局限性,应用于HIV-1分型中有更宽的检测范围、更灵敏检测下限,可广泛适用于HIV-1的分型。在阳性干血斑(dfled blood spots,DBS)中,HIV-1 DNA检测灵敏度也达到了100%,结果与血浆的HIV RNA水平显著相关(r=0.765,P
3.LNA在抗病毒基因治疗中的应用
3.1HBV基因治疗 HBV是一种有包膜的嗜肝DNA病毒,目前HBV可被分为A-J共10种基因型,每种基因型又可进一步分为若干个基因亚型。流行于我国的HBV基因型主要为B和C基因型,其中,B型又以B2亚型为主,主要流行于广西、广东、海南等南方地区:C型主要有C1和C2两种亚型,主要流行于我国北方地区。乙肝病毒感染可引起病毒性乙型肝炎,是一种传染性较强的疾病,如果得不到有效控制,易发展为肝硬化甚至肝癌,对人类的危害已经成为全球性问题,而中国是重灾区之一。目前临床上治疗慢性乙型肝炎仍然缺乏特效药物,主要应用核苷酸类似物或干扰素等药物抗病毒治疗。这种抗病毒疗法虽然在一定程度上能降低人体内的病毒载量,但无法完全清除,因此需探索一种更有效的策略治疗乙肝病毒引起的乙型肝炎。基因治疗是近年来的研究新热点,其中反义LNA做了大量的研究并取得了一定的成果。反义LNA治疗,其作用原理是通过与特定的病毒mRNA结合,发挥基因“封条”或酶切割作用,使靶mRNA表达受抑制或降解,从而达到治疗目的。LNA起到了增加反义寡核苷酸的热稳定性和亲和力作用。在体外细胞实验中利用拉米夫定抗病毒药物与HBV S基因反义LNA对比抗病毒效果,研究发现,拉米夫定对HBV DNA抑制效果明显,但对HBsAg、HBeAg抑制较弱,而反义LNA对这三个检测指标都有明显的抑制作用,效果比拉米夫定更好。邓益斌等在细胞实验中设计反义LNA研究其在细胞的抗病毒效果,实验证明了对HBV DNA、HBsAg、HBeAg有强的抑制作用,且对细胞的新陈代谢无明显影响。在体外细胞实验中,反义LNA对HBV的复制和表达表现出了强抑制作用。在进一步的研究中针对HBV S、前C/C、S/C靶点设计反义LNA,并在转基因小鼠体内验证对HBV抑制其表达,结果发现,和细胞实验一样对HBV有明显的抑制作用,通过实验检测小鼠血清肝功能和肾功能指标及肝、肾组织结构病理检查,与对照组相比,锁核酸治疗组的肝功能和肾功能无明显差异,表明了锁核酸在体内的无毒性和安全性。单靶区和双靶区对HBV都有较强的抑制作用,但双靶区抑制效果明显高于单靶区,证实了联合多位点设计的反义LNA能更有效抑制HBV。这些研究都证明了HBV的反义治疗是有效的,不过由于反义治疗的作用位点是mRNA,虽然一定程度上能抑制HBV的生成,但是并没有从源头抑制HBV DNA,其可以不断地表达。因此提出抑制HBV DNA的反基因治疗可能获得更大的抑制效果。反基因治疗是由外源特定寡聚脱氧核苷酸与病毒双链DNA的特定区域专一性结合,形成三链DNA分子,从而阻断靶基因的复制与转录,实现“反基因”之目的。在国内对反基因LNA治疗HBV有了初步研究.Y.-B.Deng等针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计反基因锁核酸细胞实验,研究对HBV的抑制和表达,实验结果表明,该实验对HBV具有明显的抑制能力。Sun z等在实验中证明了通过脂质体介导的反基因LNA能有效地穿过细胞核与靶HBV DNA发生特异结合而抑制其复制表达,抑制能力比反义LNA与pgRNA的抑制作用更强,显示出了反基因具有更强大的抑制能力和发展空间。但是目前的研究只是在细胞实验中进行,是否在体内一样具有抑制作用和安全性有待进一步的研究。
3.2HCV基因治疗 丙型肝炎是HCV引起的一种传染性疾病,其传播途径主要是通过血液进行传播,急性感染者有70%-85%可发展为慢性丙型肝炎,如果得不到有效治疗,长期发展可能转变为肝硬化、肝癌。因为丙型肝炎及其引发并发症每年造成的死亡人数为35万-50万。HCV在分类中属于单股正链RNA病毒,由5’非编码区(5’NCR)、结构区(C、E区)、非结构区(NS区)和3’非编码区共4个区域组成,其中5’非编码区和结构区C区的序列非常保守。5’NCR中的内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site.IRES)是HCV基因组中的翻译起始位点,是HCV复制所必需的元件之一,其在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用。Christopher J.Nulf等针对IRES设计反义钛核酸(peptide nucleic acid,PNA)和反义LNA与IRES序列关键位点结合以达到阻断翻译的目的,研究结果发现,PNA和LNA都能有效地侵入HCV IRES的重要序列并阻断翻译。而Carl Laxton等在研究中不仅证明了反义LNA的有效抗病毒活性,半衰期长(>5天),到达肝最大浓度>100倍体外抗病毒活性所需的浓度,而且也验证了其低的细胞毒性。近年来,在脱氧核酶的两条结合臂上增加LNA而形成的锁核酸核酶(LNAzyme)切割破坏IRES和C基因抑制病毒基因的表达也取得了一定的进展。针对HBV 5’非编码区合成LNAzyme、硫代DNAzyme、DNAzyme三种核酶,实验结果发现,三种核酶中,LNAzyme对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达具有更强的抑制作用,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞活性未发现有明显改变。另一研究中观察双基因靶位和单基因靶位抑制作用时,结果HCV RNA和荧光素酶的抑制率在各组中分别为:单靶区NCR组62.12%,66.49%;单靶区C组61.39%,65.06%;双靶区NCR/C组75.37%,73.30%,结果表明了双基因靶位的抑制率优于单基因靶位。微小RNA(microRNA,miRNA)由21-25个核苷酸组成,属于非编码RNA。肝脏中含有大量的miRNA.而miR-122是含量最多的一种.约占肝脏所有miRNA总量的72%。miR-122对肝脏的正常功能和分化调节具有关键作用,但在丙型肝炎患者中大量表达,能促进HCV的复制和蛋白的表达。Miravirsen(SPC3649)是一种由LNA修饰的硫代反义寡核苷酸治疗药物,它的作用原理是与miR-122发生特异性结合,并且形成高度稳定的杂交双链,阻断miR-122对HCV的调节,最终抑制HCV的复制。最近报道,SPC3649通过结合pri-和pre-miRNAs的茎-环结构而抑制miR-122的生物活性。最初实验用antagomir-122,miR-122ASO,LNA修饰的寡核苷酸在鼠体内进行,结果三组都有效地减少肝脏miR-122水平和血清胆固醇水平,并未观察到毒性效应。在这些ASO中,LNA高亲和力修饰寡核苷酸(SPC3649)对miR-122抑制能力最强。因此SPC3649随后进一步在灵长动物上研究其安全性和效果。SPC3649的安全性测试在猕猴身上研究,显示可以降低血清总胆固醇并有剂量依赖性,无严重毒性作用,证明了miR-122抑制药物没有影响肝的形态和功能。HCV慢性感染的黑猩猩用SPC3649治疗显示长期抑制HCV复制而没有副作用。随着临床前研究的成功完成,SPC3649进入人类临床试验。第1阶段的研究数据表明SPC3649有好的耐受性和剂量限制毒性,减少血清胆固醇水平。第2a阶段临床研究,评估多剂量SPC3649治疗miR-112安全性、耐受性、药物代谢动力学、疗效,研究发现,SPC3649具有广泛的抗病毒活性,有剂量依赖性和持续减少血清胆固醇和HCVRNA水平,并且未观察到HCV基因组中存在mir-122结合位点的病毒抵抗,也未发现剂量限制性的不良反应事件。SPC3649比其他抗HCV药物有几个优点,不像大多数抗病毒药直接作用于HCV,而是作用于miR-112能避免由于HCV基因组突变引起的药物抵抗。
3.3HIV基因治疗 自从高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)被用于临床治疗艾滋病以来.虽一定程度上抑制患者HIV-1并改善病程发展,但是长期HAART会导致病毒耐药和突变等问题,从而使治疗艾滋病的效果逐渐下降。目前应用于HIV-1基因治疗的策略主要包括反义RNA、RNA适体、核酶、RNA干扰、RNA诱饵和一些基于蛋白的抑制剂。LNA被应用这些治疗方法中是为了增加靶向性和稳定性而增强抑制HIV-1作用。有研究比较反义DNA、反义LNA、LNA核酶、DNA核酶在细胞培养中阻断HIV-1 RNA模板反转录和二聚作用的生物活性并抑制HIV-1生成,结果证明抑制HIV-1表达能力:反义LNA>LNA核酶>DNA核酶>反义DNA。Elmen J等在HIV-1保守区二聚作用起始位点(dimerization initiation site,DIS)应用反义LNA提高了抑制HIV-1的性能。另有研究鸟嘌呤-四联体序列5’-TGGGAG和17-mer序列T30177利用LNA修饰后抗HIV-1活性提高8倍。HIV-1反式激活应答元件(TAR)RNA59残基茎,环结构干扰HIV反式激活蛋白Tat和其他细胞因子刺激病毒长末端重复(long terminal repeat,LTR)的转录延长,从而达到阻断全长的艾滋病毒转录和复制的目的。研究中发现长度相同(12个残基)的2’-0-甲基寡核糖核苷酸(2’-O-methyl oligoribonucleotide,OMe)、OMe/LNA、PNA都同强度与TAR结合并抑制HIV-1转录。此外,当通过阳离子脂质体转染Hela细胞.发现3’-羧基荧光素标记的12-mer OMe/LNA嵌合寡核苷酸可抑制特定序列。另有报道发现OMe寡核苷酸与40%-50%LNA(包括a-L-LNA or 29-硫代-LNA)杂合效果最佳,且长度不能低于12残基。LNA应用于HIV-1基因治疗方法中还有RNA适体。适体(aptamer)是奶逋夤押塑账嵘秆〉哪芙裘芙岷习蟹肿拥囊欢DNA或RNA。适体与RNA发夹结构通过环一环相互作用相互影响.被称为识别RNA发夹结构的另一种反义寡核苷酸。其在抗HIV-1的应用研究多用于与反转录病毒蛋白Tat的肽竞争结合于TAR,即使两个配体的结合位点不重叠。一旦结合,适体TAR采用合适构象不再适合与Tat产生联系,最终抑制HIV-1。相对比,反义LNA虽与适体都具有较强的结合力和碱基配对潜能,但不能竞争于Tat。更重要的是我们发现LNA/DNA适体结合于TAR的特异性比LNA/DNA反义寡核苷酸高。
摘要
神经细胞的特化之一是其轴突,长度可达胞体直径的几百甚至几千倍.轴浆转运维系着胞体和轴突终末之间大量的物质交流,保证神经细胞发挥正常功能.轴浆转运障碍可以导致神经细胞功能受损直至凋亡.在一些视神经疾病中,轴浆转运功能的改变是最早出现的症状,因此也可能成为治疗的潜在靶点.在青光眼和视神经缺血的动物模型中,轴浆转运功能的下降是最早出现的变化之一.而Leber's遗传性视神经病变(LHON)和常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是已知线粒体功能障碍引起的视神经疾病.不难想象,长距离轴浆转运功能对能量代谢尤其敏感,因此在LHON和ADOA中可能也有不同程度的下降,但似乎并没有受到足够关注.本文首先回顾了微管和马达蛋白在轴浆转运中的作用,比较分析以上所述几种疾病的发病机制、临床表现及治疗手段,试图发现它们之间的共同特点以及这些特点与能量代谢、轴浆转运之间的潜在关系,为其治疗提供新的思路.
关键词
视神经疾病,青光眼,Leber's遗传性视神经病变,常染色体显性视神经萎缩,能量代谢,轴浆转运
神经元是一种极化细胞,即它具有树突、胞体和轴突.细胞内的物质运输是其进行生命活动的基本功能之一,而神经元轴突相对胞体极大的长度,对细胞器和蛋白质以及其他物质在细胞内的转运形成了一定的挑战.细胞内的物质运输依赖微管和马达蛋白.视网膜神经节细胞是视网膜的输出元件,它的轴突组成视神经,在一些视觉系统疾病中,视神经轴浆转运可能也会是易感环节.在青光眼中,有大量研究表明轴浆转运功能障碍的出现远早于视网膜神经节细胞的死亡.轴浆转运是一个耗能的过程,对青光眼模型的研究表明,轴浆转运障碍可能与线粒体功能受到各种影响而发生异常有关.这使我们联想到Leber's遗传性视神经病变和常染色体显性视神经萎缩这两种已明确的线粒体异常引起的视神经疾病中轴浆转运可能也会发生异常.我们比较分析了这几种疾病的病因、症状及治疗方法,试图发现提高能量代谢水平或重塑轴浆转运功能的方法,为这些疾病的治疗提供新思路.
1轴浆转运
细胞内蛋白质和细胞器的运输是进行生命活动的最基本功能之一,对神经元尤为重要.因为神经元拥有一个独特的结构———轴突,其长度可达胞体直径的几千倍.很多蛋白质和细胞器需要从胞体运输到轴突及其终末,而轴突终末从靶位置摄取的某些物质,也需要运输到胞体发挥作用,有些甚至可以影响细胞存活.细胞的物质运输系统由微管和马达蛋白组成.微管是由13个原丝聚合形成的中空的管状结构,每个原丝都是由结构相似的球蛋白α、β微管蛋白(α-,β-tubulin)异二聚体组合成的.其聚合和水解较快的一端被称为正极,另一端则为负极.正极分布于细胞外周,负极则集中在细胞核附近的中心粒.由于微管蛋白结合的鸟苷酸可以有二磷酸或三磷酸的形式,所以微管蛋白在一定条件下会表现出动态不稳定(dynamicinstability),即微管蛋白的一端会在延伸和缩短之间转换.在神经细胞的轴突中,微管的排列方向与胞体内是一致的:正极朝向突触终末而负极朝向胞体.微管是轴浆转运的轨道,微管蛋白的翻译后修饰能形成更为稳定的微管结构.Hammond等[1]认为微管的动力学特性主要是由微管蛋白的翻译后修饰等引起.2010年,Janke和Kneussel[2]发现,在成熟稳定的轴突中富含乙酰化的α-tubulin,它们与微管的稳定相关.2012年,Cho等[3]也发现在外周神经系统中的轴突损伤处乙酰化的神经微管蛋白明显减少.
与微管结合的马达蛋白有2种:驱动蛋白(kinesins)家族和动力蛋白(dyneins)家族.驱动蛋白结构与肌球蛋白(myosinⅡ)相似,由2条重链和2条轻链组成.重链的头部是球型马达结构域,尾部由2条重链组成二聚体.驱动蛋白超家族拥有至少10个家族.大多数成员的马达域在N端,向微管的正极运输,而一些成员的马达域在C端,向微管的负极运输.驱动蛋白的运输速度在2~3mm/s.动力蛋白家族则负责向微管的负极运输.轴浆转运中涉及的是胞浆动力蛋白(cytoplasmicdyneins).它们通常是重链的同二聚体,有2个大的马达域构成的头部,运输速度可达14mm/s.动力蛋白本身就是一个大的蛋白质复合体,在运送细胞器时,它们还需要和另一个大的复合体动力蛋白激活蛋白(dynactin)形成复合体.根据物质运输的速度,轴浆转运可分为快速运输和慢速运输.我们对轴浆转运速度的认识多来自于经典的脉冲追踪术,这种方法用于多种动物的在体研究,发现一部分被标记的蛋白(膜性细胞器和膜蛋白)运动速度较快,为50~200mm/d,细胞骨架蛋白如微管蛋白、神经纤维丝以及成百上千种可溶的或胞浆蛋白如代谢酶、热休克蛋白、马达蛋白等这些蛋白运动速度很慢,为0.2~10mm/d,其中微管蛋白和神经纤维丝速度最慢,为0.2~1mm/d.现普遍认为快速运输是由驱动蛋白和动力蛋白负责的顺向转运和逆向转运组成.慢速转运多为顺向运输,也有极少的逆向转运被报道.最经典的研究是Fink和Gainer[4-5]将轴突中间标记,之后观察到慢速运输向两个方向进行.之后又有动力蛋白参与慢速运输的相关报道[6-7].一些研究表明,无论是快速运输还是慢速运输,都是由分子马达参与的,之所以后者速度慢,是因为其在运动过程中存在长时间的停顿[8-9].当然,慢速运输的机制比快速运输复杂得多,而且可能不止上述一种[10].
2视神经疾病及其与轴浆转运障碍的可能关系
视网膜神经节细胞是视网膜的输出元件,以动作电位编码光刺激,通过其轴突,即视神经将其信号传至更高级的视觉中枢.绝大部分的视神经投射至丘脑外侧膝状体,换元后投射至初级视皮层,为成像作贡献.大部分的轴突亦有分支投射至中脑上丘,控制眼动.另有一些节细胞投射至下丘脑、中脑等一些核团,控制瞳孔反射、昼夜节律等非成像视觉功能.视神经病变,如青光眼、Leber's遗传性视神经病变及常染色体视神经萎缩等,它们病程最终的结果都是视网膜神经节细胞退化从而致盲.
2.1青光眼青光眼是仅次于白内障的第二大致盲疾病.青光眼是由主要风险因子眼内压的升高[11]或其他多因素导致的以视凹陷、视盘受损后周边神经纤维层变薄、视网膜神经节细胞退行性病变、视功能进行性损害为主要特点的慢性进展性疾病.青光眼通常被分为开角型青光眼和闭角型青光眼两类.前者起病时并无明显症状,早期患者视力并无明显损害,随着疾病的逐渐发展,视盘周围神经纤维进一步丢失,患者视野表现为进行性缩小,疾病终晚期患者视力丧失.闭角型青光眼则为急性发作,有眼压增高及疼痛.少数患者表现为以视黄斑束最先损害的中心视野缺损.两种类型青光眼最终均可致盲.青光眼病因复杂且尚无定论.转基因动物DBA/2J小鼠中部分动物眼压随年龄上升,较好地模拟了人类开角型青光眼.2008年,Buckingham等[12]的研究表明:3月龄时小鼠眼压上升;6月龄时,轴浆转运荧光金的功能开始下降;12月龄时轴突断裂;18月龄时细胞体固缩,凋亡.Dengler-Crish等[13]在2014年也在DBA/2J的小鼠模型中讨论了轴浆顺向运输和逆向运输障碍发生的关系问题,他们发现在9~10月龄的小鼠中,CTB标记的上丘面积的减少较荧光金标记的节细胞数量的减少更甚,表明轴浆顺向运输障碍要比逆向运输障碍更为严重.在青光眼中,也有多项研究显示与轴浆转运相关的马达蛋白确实出现异常.2006年,Martin等[14]采用了一个激光灼烧房水流出区域造成房水循环受阻的慢性青光眼大鼠模型,他们发现在眼压升高3天后,视神经处72ku的动力蛋白中间链就发生积累.在急性高眼压模型中,将眼压升至较高水平时,荧光金标记的大鼠视神经轴浆的逆向转运功能明显下降[15],而眼压升至40~50mmHg时,大鼠逆向转运功能先下降,不过在一周后又恢复至正常水平[16].普遍认为青光眼中视神经是轴浆转运最早发生障碍的部位[17-21].2011年,Chidlow等[22]发现,在慢性激光灼烧小梁网的慢性青光眼模型中,视神经处蛋白的积累早在模型后8h就已发生,且在24h蛋白的积累达到顶峰.但近来也有研究显示轴突远端先受影响[23].何士刚实验室长期观察了急性视网膜缺血模型后视网膜神经节细胞轴浆转运功能,轴突连续性及视功能的变化,证实了轴浆转运功能的下降早于轴突连续性的变化,并且轴浆转运功能的下降与视锐度和反差灵敏度测试表征的视功能下降有很强的相关性.我们发现,一旦出现视功能障碍即进行治疗,视功能便可基本恢复至正常状态[15].这些证据表明,早期的视功能下降,可能包括早期的视野缺失,并非完全是不可逆的.恢复了轴浆转运,就有可能逆转视功能的下降.有研究表明,青光眼的发生及视觉丧失与线粒体功能障碍有关[24-25].眼内压升高会使视网膜处于供血不足的状态,导致线粒体功能受损[26].视网膜神经节细胞中的线粒体作为独立的部件,通过轴浆快速转运,从胞体运输至轴突末梢[27-28].这个过程是由驱动蛋白和微管介导的,需要ATP的参与.在大鼠中,线粒体的生命周期一般为3周[29].一旦能量代谢异常,会影响线粒体在节细胞中的运输,进而造成恶性循环,更严重地影响能量代谢和轴浆转运.2015年,Takihara等[30]发现:在4月龄的慢性青光眼模型小鼠上,节细胞死亡之前轴浆转运线粒体的数量就已经减少,但线粒体的其他转运指标,如持续时间、转运距离和工作周期等均未发生变化;到23~25月龄时,转运线粒体的时间、距离及工作周期均有下降.青光眼发病和进展随年龄增长而增长,这可能也和线粒体随着年龄的增长所出现的结构和功能的退化相关.比如氧化磷酸化能力减弱、活性氧的产生增加、线粒体DNA的突变增多等等.因为视神经中含有丰富的线粒体,对这些变化可能尤其敏感,而视神经的损害,进而会影响视觉功能[25].最初治疗青光眼的目标主要是降低眼内压.使眼压下降20%~40%能够将视野缺失的速度减半[31-32].最早降眼压的滴眼液于1875年问世,目前常用的降眼压药物主要为β受体阻断剂、碳酸酐酶抑制剂、前列腺素类似物、α2肾上腺素受体激动剂、拟副交感神经药物等.除了单一成分的滴眼液之外,也存在一些复合制剂.以上这些滴眼液可以减少房水的形成或增加其排出.不过由于青光眼病因不明,也可能是视神经轴浆转运障碍造成的神经营养因子的运输障碍[33],以致视网膜神经节细胞缺乏神经营养因子(尤其是脑源性营养因子BDNF和神经生长因子NGF)而死亡[34-35].例如,2000年Pease等[36]发现在急性高眼压的猴子和大鼠的视神经处BDNF及其受体TrkB都有积累.因此,通过直接或基因治疗方式在视网膜中施加神经营养因子,保护神经细胞及改善能量代谢和轴浆转运功能[15,37-38],可能也不失为治疗青光眼的策略之一.
2.2常染色体显性视神经萎缩(ADOA)常染色体显性视神经萎缩(ADOA)也叫做Kjer's视神经萎缩,因丹麦的眼科医生Kjer发现了19个ADOA家族而得名,其遗传遵循孟德尔遗传法则.随后在英国、美国和法国又有大的家族被报道患有该病.引起ADOA的基因OPA1直到2000年才被发现[39-40],是由染色体3q28的核DNA编码,而该基因的蛋白质产物靶向线粒体发挥功能,其线粒体损伤致疾病的本质才完全被证明.ADOA在全世界的患病率达3/100000,在丹麦,它的发病率更是高达1/10000[41].该病发病较早,在儿童时期就已发病.ADOA在发病初期没有明显症状,且多为双侧视神经病变.患者一般会经历缓慢的疾病恶化过程———视力逐渐退化.在个别成人中也有视力急剧下降的报道.眼底检查发现在视盘颞侧有双边对称的白色区域,说明汇聚至视神经轴突的神经纤维确实减少.ADOA视野的丢失从中央开始,ADOA患者还有视敏度下降、色觉受损等症状.有一小部分患者会有一些额外的临床表现,如神经性耳聋、进行性眼外肌麻痹、共济失调和肌肉病变等[42-43],被称为ADOA+.截至目前,已发现3个与ADOA相关的基因:OPA1、OPA3和OPA7,均编码线粒体内膜上的蛋白.OPA1编码的蛋白是动力蛋白相关的鸟苷三磷酸酶,该蛋白在线粒体融合和细胞色素C的释放中发挥重要作用[44],并作为一个关键蛋白在线粒体动力学网络中发挥作用.线粒体的动力学是指线粒体沿细胞骨架的运动以及线粒体形态的变化,由融合和分裂控制,其正常进行能保证线粒体正确选择形成管状结构还是网状网络.OPA1基因编码的蛋白能确保内膜的融合,它分布于膜间隙、内膜和线粒体的嵴上,另外,OPA1还能在兴奋性毒性的环境下促进神经元的存活[45].所以,ADOA是由核DNA突变引起的线粒体动力学障碍致使节细胞死亡视神经萎缩的疾病.2009年,White等[46]发现,在ADOA的小鼠模型中,6月龄的小鼠模型与正常小鼠在视神经轴突形态上并无明显差异,9月龄的小鼠视神经开始出现变性,到24个月时,模型鼠视神经数量比正常小鼠明显减少,此时节细胞层的自噬小体的数量也明显增多.2010年,Heiduschka等[47]用荧光金逆行标记ADOA模型视网膜节细胞,发现20月龄的ADOA小鼠模型视网膜外周和中央节细胞的数量都明显下降.荧光金标记的节细胞减少反映了ADOA模型视神经轴浆转运的逆向运输发生了障碍.但也有研究推测ADOA并非仅由线粒体一个原因所致,OPA1的另一个作用是与嵴相互联系,从而在细胞凋亡中起作用[48].ADOA的临床表现与开角青光眼比较相似,在发病早期甚至会造成误诊.而开角青光眼患者OPA1基因的表达也可以出现异常[49].有研究发现,在DBA/2J的慢性青光眼模型视神经处,线粒体融合、嵴的体积等都有异常,且在此处OPA1基因的表达也有所下降[50].神经元的存活在一定程度上与由线粒体功能决定的能量供给直接相关.2012年,Park等[51]发现在大鼠的青光眼模型中存在自噬小体产生的现象.这些发现表明,ADOA中节细胞的死亡机制与青光眼模型有许多相似之处.对ADOA视神经轴浆转运方面的研究还很少,如果在动物模型上对顺向转运和逆向转运进行详尽的研究,也可能为该疾病的治疗提供线索.目前,ADOA还没有有效的治疗手段.在一个果蝇的ADOA模型中发现增加的活性氧能够影响果蝇的病理学表型[52],这使抗氧化治疗成为可能的方案.因为ADOA是显性遗传,对患者的基因检测及基因治疗,理论上应该可以获得满意的疗效,但目前尚未见到对ADOA基因治疗的报道.而青光眼和ADOA相似的症状及神经节细胞相似的凋亡机制提示,神经保护及轴浆转运的恢复,可能也不失为治疗ADOA的策略.在凋亡诱导因子(AIF)基因突变的小鼠中,用AAV携带正常的AIF基因进行眼内注射,显示基因治疗后能够减少视神经的萎缩[53].AIF是核基因,其缺陷也影响到视网膜线粒体功能.所以这项研究,为用基因治疗修复与线粒体功能相关的核基因治疗视神经萎缩,为ADOA可能的干预提供技术路线.
2.3Leber’s遗传性神经病变(LHON)150年前,第一例LHON由vonGraefe报道,而因TheodorLeber于1871年对其进行深入的临床分析而得名.这种遗传的视神经病变在任何一个年龄阶段都会出现,但多数发生在20~40岁之间,且往往双眼都患病.由于在男性青年中多发,一度被认为是伴X染色体遗传.1988年,Wallace和他的同事们[54]发现了第一个LHON相关的线粒体基因的突变———ND4基因,一个编码NADH脱氢酶的基因,此病才被证实是线粒体染色体发生突变的母系遗传.随后,其他的线粒体突变基因也被发现[55-56].导致LHON最重要的原因是线粒体基因编码涉及电子传递链复合体Ⅰ蛋白的突变.有研究表明,LHON中节细胞的死亡机制可能是细胞凋亡[57],而离体研究表明这可能是由于ATP供给不足造成葡萄糖的合成困难而引起的[58].复合体Ⅰ是活性氧的主要来源,LHON可能由于活性氧的增加导致节细胞凋亡.另有研究表明,已有突变的线粒体阻隔Ca2+的能力也有所下降,致使线粒体内Ca2+的浓度增加[59].这些改变都可能导致神经节细胞的损伤甚至凋亡.LHON病人也会表现出视敏度下降、色觉障碍,严重时,视神经成杯状并萎缩[26],这可能是因为视神经的黄斑束处纤维更薄更容易受到破坏,也可能是由于能量代谢异常引起轴浆转运功能下降而在视神经上表现出的相似症状.但是,目前似乎并没有关于LHON中轴浆转运功能是否或如何受到影响的报道.不过,线粒体功能障碍可能对轴浆转运有重要影响也不是无端的推测.2000年,Sadun等[60]对两例LHON患者的节细胞死亡及视神经减少的情况进行了分析,发现这两例LHON患者的视神经轴突减少量从95%~99%不等,位于中央的较小直径的轴突损伤最为严重,直径大的轴突相对比较完整.当然由于患者年龄、患病时间等因素的不同,不同LHON病人的视神经减少程度也不尽相同.关于治疗LHON的探索一直在持续,但到目前为止还没有十分有效的方法.常规的是化学药物治疗,主要研究有维生素和溴莫尼定.虽然维生素B12不能成功治疗LHON,但它在由LHON维生素B12缺乏引起的视力丧失方面还是能够发挥一定作用的[61-62].溴莫尼定是一种肾上腺素α2受体激动剂,能够通过上调Bcl-2减少节细胞的死亡[63-64],但由于受试者招募数量和并未达到减轻视觉损伤的目的,该药在临床试验阶段即被终止[65].另外还有一些抗氧化的药物,如辅酶Q10和艾地苯醌.辅酶Q10是线粒体电子传递链的一个辅因子.但现在还没有辅酶Q10治疗LHON成功的案例,一个可能的原因是辅酶Q10从磷脂膜往线粒体的传送存在障碍.艾地苯醌是辅酶Q10的衍生物,克服了上述辅酶Q10的缺点.2009年,Eng等[66]的研究显示,7名接受艾地苯醌治疗的LHON患者的视敏度、色觉及视野都有所恢复.LHON最根本的原因是线粒体基因ND4的突变.从目前的情况看,也许可以通过基因治疗根治LHON.2012年Yu等[67]成功地将能够表达线粒体ND4基因的AAV病毒载体注射至LHON小鼠眼中,发现在线粒体中ND4DNA的表达升至80%.Bainbridge等[68]发现,经过基因治疗的患者视敏度在治疗后6~12个月时恢复至最高水平,12个月之后又有所下降,但较未治疗眼仍为明显好转.从上述讨论可以看出,基因治疗对LHON来讲是从最根本致病机理出发的一种治疗方法,也是效果最为显著的一种方法.因为LHON是一个双侧眼均病变的视神经疾病,且发病时间有一定的差别,所以在确诊后对未发病眼的干预,推测可以达到令人满意的疗效.不过,基因治疗后可能的免疫反应会影响其实施,如何用最小剂量的载体病毒表达出最多的ND4蛋白[69],也是一个亟待解决的问题.
3总结与展望