发布时间：2024-01-02 10:36:44
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的细胞生物学研究样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
关键词： 细胞生物学 考试方法 改革策略
细胞生物学作为生物学相关专业的基础课程，其考核环节一直为我国高校相关专业所重视。传统细胞生物学课程的考试环节主要以闭卷检测作为考核方式，以考试分数作为标准对学生的学习能力及学习成绩进行评定。这种考核方法难以有效地反映学生的综合素质，因此对细胞生物学课程考试方法进行改革具有一定的必要性。
一、细胞生物学课程考试改革的原则与思路
（一）考试方法改革原则
由于细胞生物学课程专业性及理论性较强，对该课程考试的改革应以培养学生的自主创新能力及动手实践能力作为切入点，根据学生的实际专业需求及个人能力的差异性对学生能力进行评价[1]。对专业成绩的评述不应单纯地以闭卷理论试卷成绩为最终成绩，应当综合评价学生日常课堂表现、实验课表现及课堂讨论等环节表现出的能力，并对成绩比例进行合理分配，具体考试方案由各专业教研部门自行确定。通过引入综述论文、课堂发言、实验课表现等环节的成绩评定，可以有效提高学生的学习兴趣。
（二）考试方法改革思路
对细胞生物学课程考试方法的改革，主要将考试成绩合理地划分为“闭卷理论考试（60%）+论文综述（10%）+实验课表现（20%）+日常课堂表现（10%）”四个部分。
1.对学生日常课堂表现进行评价
学生的学习活动以课堂学习为主，因此对学生日常课堂表现进行客观评价可以有效地反映学生细胞生物学课程的知识水平及能力基础。因此，将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为日常课堂表现的分值，主要对学生课堂参与程度、讨论问题积极性、师生互动与沟通、课堂出勤率等方面进行考察，从而有效地提高细胞生物学课程教学质量。
2.对学生实验课表现进行考核
细胞生物学课程主要由理论课及实践课构成，实践课教学可以有效地对理论进行验证，是学生深化理论、接触生物学领域的重要途径。传统细胞生物学课程的考试主要侧重期末闭卷考试的考试成绩，对实验课考核重视程度不足，导致绝大多数生物教师在教学过程中缺乏相应的重视。将细胞生物学课程考试成绩中的20%作为实验课表现的分值，可以有效地提升学生实验操作的积极性。
3.设计论文综述环节进行考评
为了提升细胞生物学课程的考评的合理性，可以设计相应的论文综述环节，对学生整体知识结构的掌握能力进行考核。论文综述环节可以在考试周前一周至两周进行，由教师提前布置相应的论文论述主题，给予学生充足的时间撰写论文、制作幻灯片，在考核过程中由学生自主上台进行论文汇报，再由其他学生进行自主提问。在评分过程中，可以将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为论文综述环节的分值。
二、细胞生物学课程考试改革应注意的问题
（一）加强相关教师的素质培训
随着新课程改革的深化，虽然学生成为课堂教学活动的主体，但教师仍然处于主导者地位，教师的职业素质及教学观念直接影响细胞生物学课程考试方法改革的贯彻效果。因此，为了保证细胞生物学课程考试改革的有效性，我国高校相关专业应当开展周期性培训，培养生物教师相应的职业素养，相关专业教研室应根据教学活动的推进对教师进行跟踪性的培训，积极开展教学前期培训、教学中期检测及教学末期总结，保证生物教师可以明确细胞生物学考试方法改革的必要性，并从考试改革入手提高课堂教学质量。
（二）贯彻落实相应的考核操作
在明确了细胞生物学课程考试方法改革的原则与思路之后，应当将相应的方案与思路落实到实践中，用实践检验理想化的方案，提高细胞生物学课程考试方法改革的合理性[2]。在实际考核操作过程中，教师应当制定相应的规章制度明确相应的考核流程，并对学生课堂表现、课堂出勤情况等评价因素进行了解。在实际考核过程中，可以打破传统单一性由教师评价学生的教学模式，引入相应的学生互评、学生自评评价机制，尊重学生实际能力的差异性，对学生成绩进行合理的评估。
（三）在考核过程中加强教师的协作
由于细胞生物学课程考核具有较强的专业性及理论性，且考试改革涵盖面与考察面较为广泛，学生成绩考核工作难以由一个教师单独完成，因此应当以过程性目光看待细胞生物学课程考核工作，加强各环节教师的协作与沟通。在学生成绩评价过程中，由不同的教师负责学生日常表现统计、学生论文综述情况、学生试卷批阅等环节。在过程性评价中教师之间进行合理化分工，可以有效提升学生成绩考核的合理性。
（四）引导学生注重日常学习过程
细胞生物学课程考核不仅具有检测教学成果的功能，还具备评价功及引导功能[3]。传统侧重期末考试成绩的考核模式对教学成果的评价较单一，很容易导致学生陷入学习时仅注重考点的学习误区。对细胞生物学课程考试方法的改革对学生日常表现、实验课表现等方面进行综合考核，因此教师应当注重引导学生的日常学习课程，尽可能地消除功利性的学习目的。
总而言之，细胞生物学不仅是一门集理论性、创造性为一体的学科，而且是临床医学及生物学的学科基础。在教学考核过程中，相关教师应当明确考试的评价功能及引导功能，树立素质教育理念，利用多种形式的综合性考核内容对学生学习情况进行考评。
参考文献：
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[3]杨丽，张君，谢菁，徐文静，王岩.医学细胞生物学考试方法改革的探讨与实践[J].教育教学论坛，2014，31：69-70.
[关键词]RGD；人牙周膜细胞；黏附；增殖；碱性磷酸酶
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0054-03
The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell
BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan
（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）
Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P
Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase
精氨酸 -甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多种细胞跨膜蛋白整合素的特异性配体，许多黏附蛋白所共有的细胞间及细胞-细胞外基质识别的最小序列，这一序列在介导细胞黏附、迁徙和生长方面起重要作用。牙周膜细胞在牙根面上的附着和增殖是牙周组织新附着的关键，本实验目的是观察离体细胞培养条件下，外源性RGDS对牙周膜细胞的影响，为进一步的临床研究工作提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培养板（Coster）， DMEM培养液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶联免疫检测仪（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑盐（MTT Sigma），ALP试剂盒，倒置显微镜（Olympus，Japan）。
1.2 人PDL的体外培养：取13～17岁因正畸需要拔除的新鲜前磨牙，随即在无菌条件下用PBS缓冲液（含青、链霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并冲洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪成1mm3碎块，均匀铺于培养瓶底，瓶底向上，加入适量含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液，在饱和湿度、50ml/LCO2、950ml/L空气、37℃标准环境下孵育2h，翻转，培养至长出牙周膜细胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法进行传代，用免疫组化SABC法进行角蛋白和波形丝蛋白染色，波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明为中胚层组织来源。取第4代细胞用于实验。
1.3 PDL细胞黏附性的测试--固相结合分析[1]：将RGDS溶于PBS液，分别制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4种浓度，每浓度为一实验组。将各浓度组按每孔50μl包被96孔板，每种浓度4孔，阴性对照为10g/L BSA。将96孔板置于4℃，过夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封闭1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL细胞，2.5g/L胰酶消化，离心，收集细胞，用不含血清的DMEM培养液吹悬细胞，形成5×108/L的细胞悬液，以每孔100μl接种于96孔板，37℃，50ml/LCO2条件下培养120min。取出培养板，PBS洗2次以去除未贴壁的细胞，2.5g/L胰酶消化，离心，将细胞悬浮于200μl无血清DMEM，血球计数板进行细胞计数，计算细胞总量。
1.4 PDL细胞伸展性的测试：实验分组及96孔板的包被与实验方法1.3相同，用无血清DMEM调整细胞浓度至107/L，每孔接种100μl， 标准环境下孵育120min，倒置显微镜下观察各孔并照相。计数伸展细胞（即至少有一个胞浆突起的细胞）数和未伸展细胞数，每组至少计数100个细胞，计算伸展细胞的百分率。
1.5 RGDS对PDL细胞增殖的影响：实验分组及96孔板的包被与实验方法1.3相同，用无血清DMEM调整细胞浓度至107/L，每孔100μl接种于96孔板，10ml/LDMEM培养24h后，PBS 洗去未黏附细胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，将96孔板置37℃、50ml/LCO2条件下继续培养5天后，MTT法测不同浓度RDGS对PDL细胞的影响。
1.6 RGDS对PDL细胞碱性磷酸酶（ALP）的影响：将PDL细胞按1.5的方法培养5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃过夜。次日每孔加碱性磷酸酶抗体100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl终止反应。酶联免疫检测仪410nm检测A值。
1.7 数据分析：运用统计学软件SPSS10.0进行组间t检验， P
2 结果
2.1 RGDS对PDL细胞黏附性和伸展性的影响：如表1所示，随着RGDS浓度增加，其促进PDL细胞的黏附率的作用逐渐增强，当浓度为12.5mg/L时，与对照组相比较，既有促进细胞黏附作用（P
细胞伸展性实验也说明，在RGDS浓度为12.5mg/L时，即有促进细胞伸展功能（P
2.2 RGDS对PDL细胞增殖和ALP的影响：RGDS在50～100mg/L可明显促进细胞增殖，浓度在25～100mg/L明显提高HPDL细胞的ALP的活性。见表2。
3 讨论
本实验运用固相结合分析技术，将RGDS固定于96孔板上，为排除血清中某些因素对实验结果的影响，在黏附和伸展实验中采用无血清的DMEM，在增殖和ALP活性检测时，因培养时间较长（5天），采用细胞能耐受的1%胎牛血清浓度。实验结果显示：在浓度为25mg/L可显著促进PDL细胞的黏附、伸展，而较高浓度的促进作用却不明显，可能在此浓度时细胞膜上受置已饱和，再增加RGDS并不能使黏附率明显上升。而细胞伸展性也显示，当RGDS浓度达到25mg/L时，细胞在2h的伸展率达到了50%以上，倒置显微镜下可见经RGDS处理过的细胞胞体呈梭行或多角性，既细胞有一个以上的突起，呈现良好的伸展状态。而未经RGDS处理的对照组细胞形态呈圆形，无突起或仅有少量突起，细胞伸展状态不佳。
精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）是细胞外基质中许多黏附蛋白所共同含有的一个三肽序列，它是黏附蛋白与细胞表面特异受体蛋白相互作用的识别位点。这些细胞表面膜蛋白被称为整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β两条链由非共价键连接组成的异源双体，为一跨膜结构，一端连接细胞内的骨架系统，另一端通过RGD识别位点与细胞外基质连接，形成配体-整合素-细胞骨架跨膜信息系统，从而将细胞外基质和细胞骨架连接起来，引起细胞内一系列生化改变：如：酪氨酸磷酸化、胞浆碱化、钙离子浓度提高、大量磷脂代谢产物产生等，进而影响多种组织细胞功能调控，包括胚胎发育、细胞的伸展、移动、生长、分化、血栓形成、创伤修复、肿瘤转移等一系列重要生理病理过程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用实验证实RGDS是纤维连接蛋白与其受体的特异性结合位点，可促进鼠肾成纤维细胞在生物材料表面的黏附，从此对于RGD配体与受体相互作用机制的研究引起了人们的广泛关注。许多学者[5]研究了RGD与生物材料的不同结合对细胞在粘附、增殖、迁徙等方面的影响，显示RGD与材料表面的稳定的连接是促进细胞粘附、增殖的关键。
ALP是参与骨等硬组织形成﹑代谢﹑再生的重要调节物质，它通过水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸盐，能去除钙化抑制物，提供能量，促进钙化[6]。同时ALP也是细胞分化活跃和具有成骨能力的标志之一[7]。而牙周膜细胞具骨母样细胞特性，ALP也是牙周膜细胞分化和向成骨样细胞转化的先决条件。本实验中，RGDS在浓度25mg/L即可提高牙周膜细胞ALP水平，这可能是RGDS通过激活整合素受体蛋白，引起胞内细胞骨架改变，从而促进细胞贴壁、伸展，进而促进细胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高极可能是由于牙周膜细胞数量增加引起，但无论什么原因，RGDS这种促增殖与分化的作用在牙周组织修复过程中具有重要意义。
牙周组织再生的一个中心环节是牙槽骨和牙骨质的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附着，而PDL细胞作为具有异质性的多能干细胞，其在根面上的黏附、生长、分化是形成新附着的关键。本实验结果证实RGDS可有效促进PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有学者将含有RGD的七肽固定于I型胶原材料，PDL粘附率明显提高[8]。因而如果将RGD应用于引导牙周组织再生的过程中，则有可能促进PDL细胞在根面上黏附、伸展，激活PDL细胞成骨功能，促进牙周组织再生，这对体内应用RGDS促进牙周新附着的形成有一定的指导意义。
[参考文献]
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摘要从教学内容、教学过程和考核方式等方面介绍了研究生细胞分子生物学课程的教学开展与体会，为适应多研究方向的研究生培养要求、提高教学效果提供参考。
关键词研究生;细胞分子生物学;教学;内容;考核
扬州大学硕士研究生培养方案课程设置将细胞分子生物学作为生物学一级学科的学位课程，包含植物学、动物学、生理学、水生生物学、微生物学、遗传学、发育生物学、细胞生物学、生物化学与分子生物学、生物物理学、生态学等11个生物学二级学科。扬州大学是江苏省属重点综合性大学，目前设有27个学院，11个生物学二级学科分散在生物科学与技术学院、农学院、兽医学院、医学院，各二级学科的研究方向也较广泛，如何适应这种多学院、多学科和多研究方向的硕士研究生培养要求，提高教学效果，扬州大学不断进行尝试、改革，构建了适合各二级学科培养目标要求的细胞分子生物学教学体系，现将这门课程的教学内容、教学过程和考核方式介绍如下。
1细胞分子生物学的教学内容
细胞分子生物学是随着细胞生物学和分子生物学发展而兴起的一门较新的学科，是一门在分子水平上研究基因对细胞活动调控以及各种细胞结构的形成和功能执行的科学[1]。对生物学专业的研究生来讲，本科阶段都学过细胞生物学和分子生物学这2门课程，因此研究生所开设的细胞分子生物学课程体系应该和本科生的课程体系有所区别。由于传统的细胞分子生物学教材与细胞生物学和分子生物学在内容上有很多雷同，若采用这些教材，很容易使研究生对该门课程失去兴趣。扬州大学将该门课程的教学内容分为4个部分:细胞结构、细胞遗传、细胞代谢与调控、细胞发育，该校没有选择任何固定教材，仅仅指定少数最新出版的教材作为参考书，如韩贻仁主编的分子细胞生物学[2]、Gerald Karp主编的Cell and Molecular Biology:Concepts and Experi-ments等[3]。
2细胞分子生物学的教学过程
扬州大学细胞分子生物学的授课对象差异比较大，学生的来源和专业背景也不同，在教学过程中，笔者尝试使用开放式教师、开放式教学和开放式课堂的教学方法。
2.1开放式教师
以往的研究生课程都是由固定的教师一上到底，由于教师的精力有限，不可能对细胞生物学各个领域的前沿知识都熟悉。为了解决这一问题，扬州大学采用不固定教师上课的制度，跨学科跨学院请资深教师进行授课，确保学生能够了解该领域的基本知识与前沿动态。设置的4个部分教学内容中，每一部分由1~2位专业教师负责主讲，教师可结合自己的专业背景，根据不同教学模块，设置具体的教学内容，不拘泥于任何教科书进行授课。有些教师的研究方向是植物，对植物细胞分子生物学的研究进展和前沿动态比较熟悉，讲授植物细胞分子生物学可以做到深入浅出，而对动物细胞分子生物学的讲授效果会比较差，因此主讲教师可选择来自植物、动物、微生物、病毒等研究方向的老师。对于学生，有些是来源于农学院，其背景知识和兴趣侧重在植物方面，而有些来源于医学院或兽医学院，其背景知识和兴趣侧重在动物方面，这就要求选择具有不同学科背景的教师。开展开放式的教学方式，满足不同学生的要求。
2.2开放式教学
由于细胞生物学是生命科学的前沿学科之一，因此在把握现有教材和参考资料的基础上，教学过程中要结合实际将细胞生物学相关领域的新进展、新知识、新方法介绍给学生，拓宽学生知识的深度、广度，培养其对未来工作的适应能力。
在每一个教学模块中，教师可通过不同的教学方式讲解不同侧重点的专题。如细胞结构部分包括讲了2个专题，一个是细胞内膜系统:结构、功能、蛋白质分选和膜泡运输，另一个是细胞骨架与细胞运动。内膜系统一般是指内质网、高尔基体、细胞核、溶酶体和液泡(包括内体和分泌泡)5类细胞器膜的总称，而广义的内膜系统概念也包括线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核等细胞内所有细胞器膜的总称。在本科细胞生物学教学过程中，这些细胞器的形态结构、功能和发生是分别独立介绍。虽然这些细胞器具有各自独立的结构和功能[4]，但它们又是密切相关的，尤其是它们的膜结构是可以相互转换的，转换的机制则是通过蛋白质分选和膜泡运输来实现的。在讲授内膜系统时，可通过蛋白质合成这条线将这些相关内容串联起来讲述。由于核糖体在蛋白质合成上与内膜系统互为一体，因此将核糖体也加入进来，同时向上讲可以提及细胞核中核糖体大小亚基及mRNA的合成，向下还可讲述细胞膜上的蛋白功能，从而用蛋白质合成一条线将细胞的三大结构即细胞膜、细胞质和细胞核联系了起来。同时，也启迪研究生自己去找线索，找出一根主干，将尽可能多的内容串起来。又如细胞骨架对于维持细胞的形态结构及内部结构的有序性以及在细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分化分裂等一系列方面起重要作用，因此对细胞骨架的研究是近代生命科学中最活跃的研究领域之一，它的快速发展主要得益于大型分析仪器的应用和实验方法技术的改进。在这一部分内容的教学中，可重点向学生讲解细胞骨架的研究方法，包括每种方法的原理、基本过程和结果分析，以最新的国外权威期刊上发表的细胞骨架方面的论文为例，向学生介绍细胞骨架的研究是如何开展的。
2.3开放式课堂
研究生课堂和本科生课堂相比，讲授内容量非常大。笔者一般会在课后将课件提供给学生，使他们在课堂上不用花太多精力记笔记，而是将主要精力集中到听课上，跟着教师的引导考虑问题，这样使其思维保持很高的兴奋度，且感到疲劳。在严格遵守课堂纪律的前提下，在上课时要尽量调动学生的积极性，以开拓学生的思维，培养创造性。课后要让学生自己阅读指定或推荐的原始文献，或者让他们自己到网上查阅自己感兴趣的问题，以此可培养学生阅读文献、查找资料、进行科研的能力。
3细胞分子生物学的考核方式
作为生物学一级学科硕士研究生的学位课程，细胞分子生物学的考核以考试为主，考虑到研究生学习细胞分子生物学课的目的主要是为了提高学生利用学到的细胞生物学知识解决课题研究中的问题，实用性较强，因此笔者选用开卷考试的形式，所出的试题都是综合性的分析题，在考场内学生可以查阅任何参考资料，但参考资料中没有现成的答案，促使学生综合运用所学知识，通过仔细分析才能得出答案。这种考核方式一方面提高了学生独立思考问题和解决问题的能力，另一方面也使教师了解了学生对这门课程的掌握情况，检验教学质量，很大程度上促进了以后教学的开展。
4参考文献
[1] 王石平，金安江.分子细胞生物学研究性教学模式的改革实践与思考[J].华中农业大学学报:社会科学版，2008(2):134-137.
[2] 韩贻仁.分子细胞生物学[M].2版.北京:科学出版社，2001.
与临床病理学相比，肿瘤分子生物学标记为肿瘤生物学行为的分析、治疗方式的选择、临床预后的判断提供了更客观、更丰富的信息，全文就目前国内外对膀胱移行细胞癌分子生物学标记物的研究概况作一综述。
【关键词】 膀胱移行细胞癌 标志物 分子生物学 免疫学
膀胱移行细胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易复发性，肿瘤细胞易于种植转移，临床上仅根据肿瘤病理判断预后较为困难。鉴于此，目前对其分子生物学标记物的研究愈来愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文献报道分析了相关分子生物学标记物与泌尿系统上皮肿瘤的病理分级、临床分期、复发及生存率的关系，为诊断肿瘤、制定正确的治疗方案及判断预后等提供重要的信息，本文就目前已报道的分子生物学标记物作一综述。
1 癌基因与抑癌基因
1.1 p53
p53的突变或丢失在膀胱癌的检出率为50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年龄膀胱癌患者的p53表达，发现p53异常表达在小于45岁的膀胱癌患者更为常见。大量研究表明，p53的改变与膀胱癌的分期、分级、侵袭性有关，但其是否与膀胱癌的复发及生存率相关仍有争议。Yeniyol等[2]采用免疫组化检测48例膀胱移行细胞癌标本中p53的表达，p53异常表达在不同临床分期和病理分级间差异显著，但未发现p53阳性组与阴性组肿瘤复发率和死亡率有明显差异。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出类似的结论。但另有多篇文献报道，p53与膀胱癌的复发率和死亡率显著相关。Sanchez等[4]报道复发的膀胱癌（n＝47）p53的异常表达明显高于未复发者，p53的异常表达与膀胱癌的进展和生存率相关。Wolf等报道p53异常表达与pT1G3膀胱癌（n＝30）的预后关系密切。
p53突变可能与膀胱原位癌（CIS）的生物学行为有关，导致CIS的侵袭性增加，Shariat等[5]检测47例膀胱CIS的p53及其中39例标本的p21表达，p53/p21联合分析显示出与肿瘤的复发、进展及生存率之间密切的相关性，p53（+）/p21（+）患者肿瘤复发进展和死亡的危险程度远大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。
1.2 p21
关于p21与膀胱癌的报道结果并不统一，Chatterjee等[6]检测p53、p21、pRb在164例TCC标本中的表达，结果显示p53、p21、pRb可作为判断TCC复发率和5年生存率的独立因子，三者联合分析显示出与TCC预后之间良好的相关性。Kuczyk MA等也认为p21WAF/CIP1可以作为判断膀胱癌生存率的独立预后因子。Liukkonen等[7]检测207例膀胱癌(pTa～pT1)标本中p21WAF1/CIP1和细胞周期素D1的表达，平均随访4.9年，分析其与肿瘤分期、分级、细胞增殖率（MIB?鄄1指数）、p53、bcl?鄄2、生存率的关系。结果只有MIB?鄄1指数与无瘤生存率显著相关（P=0.03），肿瘤复发率只与肿瘤分级（P=0.002）和细胞周期素D1的表达相关（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1与其他因子相比预后作用较小，有关p21WAF1/CIP1在判断膀胱癌预后中的意义有待进一步阐明。
1.3 p16 /CDKN2A
Hitchings等[8]检测78例TCC 标本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表达，多因素分析显示任何两者的改变与肿瘤的进展密切相关，p53和 p16同时表达异常者肿瘤的进展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用来判断pTa～pT1期膀胱肿瘤的进展情况。Benedict等发现肿瘤标本中p16/CDKN2A的表达与Rb的表达呈负相关，Rb强染色的标本罕见p16阳性染色，同时，伴染色体9p21的杂合丢失的肿瘤p16/CDKN2A失表达，Rb强表达。Primdahl等发现初诊即为浸润型膀胱癌p16/CDKN2A的表达显著低于继发于Ta 或T1的浸润期肿瘤，有关进一步解释尚待研究。
1.4 Rb
Sanchez Zalabardo D等[4]随访47例浸润型膀胱癌患者，发现Rb表达异常的患者肿瘤进展速度、复发率显著升高。Sunanda等检测164例TCC标本pRb的表达，得出结论pRb可作为判断TCC复发和生存率的独立预后因子。另有报道对45例T1期膀胱肿瘤患者随访发现Rb基因的丢失与pRb的异常表达明显导致患者无瘤生存率降低，此外，多篇文献报道Rb在与p21、p16、Ki67、p53等联合判断膀胱癌预后时表现出良好的相关性，可作为较理想预后因子。
2 细胞增殖相关指标
细胞核相关抗原（Ki67）是增殖性细胞核的标记物，可通过单克隆抗体MIB?鄄1检测，其在判断膀胱癌预后中的重要意义被越来越多的作者证实。Migaldi等发现老年患者膀胱癌标本MIB?鄄1指数高于年轻者，并且与膀胱癌复发率、生存率密切相关[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究发现Ki67是膀胱癌良好的独立预后因子。
Frank等[10]选取伴区域淋巴结转移的尿道膀胱肿瘤139例，手术切除肿瘤并行化疗，随访分析p53和MIB?鄄1在判断肿瘤预后及化疗疗效中的作用，结果并未发现p53和MIB?鄄1与该类肿瘤患者的预后具有显著性相关，但MIB?鄄1指数与肿瘤的化疗疗效呈显著负相关，提示MIB?鄄1可以作为判断膀胱癌化疗疗效的指标，指导临床治疗。同样，Matsumoto等对62例膀胱移行细胞癌（pT1G3～pT4M0）标本进行类似研究，平均随访34个月，发现Ki67的表达与肿瘤化疗完全缓解率显著性相关，能较好地判断疗效。
3 细胞凋亡相关指标
3.1 bcl?鄄2/bax
bcl?鄄2被认为是抑制细胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax属于凋亡调控基因bcl?鄄2 基因家族， 分别能够阻遏和促进凋亡， bax?鄄bax同源二聚体促进凋亡，bcl?鄄2?鄄bax异聚体阻遏凋亡，突变的p53蛋白可起到与bcl?鄄2蛋白类似的作用，并抑制bax基因的转录，进而抑制凋亡。
Uchida T等观察到119例膀胱癌患者中p53的表达与肿瘤分期分级相关，bcl?鄄2表达与肿瘤临床病理特征无关，但p53和bcl?鄄2同时过表达提示不良预后[11]。Wolf、Gazzaniga等也证实bcl?鄄2的表达与肿瘤复发率和无瘤生存率明显相关。但 Asci R等[12]报道年龄小于40岁患者TCC细胞浆bcl?鄄2和p53的表达分别为54%、37%，与肿瘤的进展无明显相关。同样，Fraile、Stavropoulos等报道bcl?鄄2的表达与膀胱癌的分期、分级及复发率无明显相关，提示有关bcl?鄄2的作用仍需进一步研究。
3.2 Fas/FasL
Fas与FasL都是跨膜蛋白，分别属于TNF受体和TNF家族，T淋巴细胞和NK细胞的活化可导致细胞表面FasL被激活，与Fas结合，使表达Fas的细胞发生凋亡。Lee SH等检测37例膀胱癌标本，Fas/FasL的高表达达到92％。Lee等报道43例膀胱肿瘤标本28％有Fas基因的突变。目前对血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究较多，Mizutani等[13]报道sFas或sFasL的升高预示Ta期膀胱癌患者早期复发的可能，sFas或sFasL可作为判断Ta期膀胱癌复况的预后因子。
4 血管形成因子
4.1 VEGF
与大多数实体瘤一样，膀胱癌的形成也具有血管形成依赖性，与血管内皮生长因子VEGF关系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧诱导因子(HIF?鄄1α)之间的关系及两者在TCC中的预后意义，结果显示HIF?鄄1α与肿瘤病理分级显著相关，VEGF和微血管密度（MVD）与肿瘤分级和临床分期显著相关。HIF?鄄1α与VEGF和MVD显著相关，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，导致肿瘤预后不良。同样，Santos（n＝66）也报道VEGF可作为判断膀胱上皮肿瘤的预后因子。
4.2 血栓黏合素?鄄1
血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是细胞外基质中的一种糖蛋白，分子量为430kD。TSP?鄄1被认为是惟一抑制肿瘤血管形成的物质。Grossfeld等[15]分析了163例TCC标本TSP?鄄1、p53的表达与TCC复发生存率之间的关系，TSP?鄄1表达与TCC复发 （P=0.009）和生存率（P=0.023) 显著相关，低表达TSP?鄄1患者肿瘤复发率增高，生存率降低。
5 生长因子及受体
5.1 EGFR
EGFR在众多上皮肿瘤中有较高的阳性表达，Colquhoun等[16]综述了近年来有关EGFR与膀胱癌的研究，得出结论EGFR的表达与膀胱癌的分期、分级、复发率、无瘤生存率明显相关，EGFR过表达提示肿瘤预后不佳，使用抑制EGFR活性的物质如ZD 1839等可望成为临床治疗膀胱癌等的新手段。
5.2 TGFα
TGFα在膀胱癌中的表达显著高于正常膀胱组织，Ravery等报道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表达，且与肿瘤死亡率显著相关。Ravery等分析28例早期膀胱肿瘤TGFα?鄄mRNA的表达，随访两年发现其与肿瘤复发显著相关，对判断早期膀胱肿瘤的预后有重要价值。Thogersen等则报道TGFα与EGFR的表达相关，但与患者生存率无明显相关，其在判断膀胱癌预后中的作用有待研究。
6 细胞外基质与细胞黏附分子
6.1 MMPs
Hara等[17]分析51例表浅TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)与肿瘤复发率间的关系，复发组MMP?鄄9的表达是未复发组的2.5倍，未发现MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表达的差异，MMP?鄄9高表达组无瘤生存率显著低于正常表达组。同样，Ozdemir等检测60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表达，发现只有MMP?鄄9的表达与肿瘤的分期分级相关。Papathoma等报道随着尿路上皮肿瘤分级和浸润程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表达显著升高，但两者与肿瘤的复发率无明显相关，提示其在判断膀胱癌转移和预后中的意义仍有待研究。
6.2 E?鄄钙黏蛋白
E?鄄钙黏蛋白的表达与肿瘤分化、癌细胞侵袭能力及转移可能相关。Shahrokh等检测53例膀胱CIS标本E?鄄钙黏蛋白的表达，随访131个月，多因素分析表明E?鄄钙黏蛋白是与CIS复发、进展、无瘤生存率显著相关的独立因素，提示E?鄄钙黏蛋白异常表达的肿瘤侵袭性高，需要早期彻底治疗。Rao等分析细胞支架蛋白－肌动蛋白（Gelsolin）和E?鄄钙黏蛋白在判断膀胱癌预后中的意义，结果示Gelsolin与膀胱癌进展和复发密切相关，但未发现E?鄄钙黏蛋白在判断膀胱癌预后中的显著意义，其在判断膀胱癌预后中的意义还有待明确。
与临床病理学相比，肿瘤分子生物学标记为肿瘤生物学行为的分析、治疗方式的选择、临床预后的判断提供了更客观、更丰富的信息，深入研究此类标记十分必要。目前对泌尿系统上皮肿瘤分子生物学标记物的研究虽已取得进展，但除了对个别标记物Rb、Ki67的意见较为统一外，对绝大多数标记物在肿瘤中的表达分布及预后价值仍存在争议，目前的文献报道多存在样本量小的问题，缺少大规模研究的支持，再加上免疫组化法检测蛋白受抗体选择、阳性结果判断、手工操作等外在因素影响的问题，导致研究结果之间缺乏可比性或对同类研究对象得出相反的结论，因此需要将实验方法标准化以提高研究的可靠性和可重复性。此外，由于肿瘤的进展和转移是涉及多种分子机制的极其复杂的过程，仅凭对单一预后指标的评估不能全面准确地反映肿瘤的恶性潜能，肿瘤免疫标记物最终的临床应用可能是多个指标的综合评估。
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目的初步探讨何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法MTT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有不同的作用，其中D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增多，B和C流分对细胞的增殖影响不大，而A流分对血管内皮细胞具有抑制生长作用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血管内皮细胞生长的活性物质。
【关键词】 何首乌 聚酰胺柱色谱 人脐静脉血管内皮细胞 MTT比色法 HE染色法
Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However， there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast， fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs ， which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
Key words: Polygonum multiflorm Thunb.； Polyamide column chromatography； Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)； MTT colorimetric assay； HE stain
何首乌Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首乌的干燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效［1］。现代药理学研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有关［1，2］。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究表明，其具有清除自由基［2］、降低胆固醇［3］、保护肝脏等［4］作用。本实验采用MTT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，为何首乌的进一步开发和利用提供依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片购自广西医药公司；人脐静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。
1.2 仪器
RE-52型旋转蒸发仪(上海博通)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；紫外线检出器(日本)；二氧化碳培养箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶标仪；倒置相差荧光显微镜（Olympus CXZIFSZ）；生物显微镜（日本Olympus）。
1.3 试剂乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龙化工)；冰乙酸(上海实意化学试剂有限公司)；无水乙醇(重庆川江化工)；氯仿(广东省化学试剂工程技术研究开发中心)，以上试剂级别均为分析纯。RPMI1640培养基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
自配试剂 ：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。
2 方法
2.1 何首乌流分提取分离取2 kg何首乌粉用4倍量70%乙醇回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水-乙醇为洗脱剂对正丁醇层浸膏进行分离，收集各流分；点样，在365 nm处用紫外灯观察，并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并相同流分，减压浓缩。按洗脱顺序分别得到A，B，C，D流分组。
2.2 活性研究
2.2.1 细胞的培养人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37℃，5％CO2条件下培养。
2.2.2 MTT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。将稀释的细胞悬液按100 μl/孔接种至96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h至细胞贴壁后，选择A，B，C，D 4种流分，每组设5个浓度梯度加入至96孔板中，每个浓度设3个平行孔。同时设PBS空白对照组6孔，继续培养72 h，取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2条件下孵育4 h，弃尽孔内液，每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT产物。振荡30 s，用酶标仪于490 nm处测定每个孔的吸光值A值。计算存活率：细胞存活率(%)=(用药组平均A值/对照组平均A值)×100%
2.2.3 HE染色法观察流分对人脐静脉血管内皮细胞形态的影响取贴壁生长的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。 将稀释的细胞悬液按2 ml/孔接种至6孔板，加入已高压灭菌的盖玻片，培养24 h后，加入不同浓度的流分，药物组设定如下：A流分组、D流分组，每组设两个浓度梯度，每个浓度设2个平行孔；同时设2孔空白对照组。培养24 h后，取出盖玻片。用95％乙醇固定，苏木精及伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，摄像。
3 结果
3.1 MTT实验结果不同浓度的流分分别作用于人脐静脉血管内皮细胞后，采用MTT法测定其对细胞生长的作用。其中流分D对人脐静脉血管内皮细胞的生长具有促进作用，出现明显的量效关系，即浓度越高，存活率越高。流分A对人脐静脉血管内皮细胞具有一定的抑制生长作用。流分B，C与对照组比较，基本无差异。结果见表1。
表1 何首乌提取物4种流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的作用(略)
3.2 细胞形态学改变经HE染色后显微镜观察，可见正常的人脐静脉血管内皮细胞呈梭形，细胞浆丰富，均匀，细胞核规则，呈紫蓝色，核内染色均一。A流分组对细胞具有抑制作用，光镜下观察到细胞的数量减少，部分细胞特别是高浓度组出现胞浆减少，核固缩现象。D流分组对细胞具有明显的促进生长作用，尤其是高浓度组表现为细胞生长旺盛，核分裂相增多，细胞数量增多。见图1。
4 讨论
聚酰胺是通过己内酰胺聚合而成的尼龙-6（锦纶、卡普隆）及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，是一种白色多孔非晶型粉末，其分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的羟基（或羧基）形成分子间氢键而将其吸附。分子中酚羟基数目越多，芳香化程度越高的化合物与酰胺基的结合力越强，从而实现与其它物质的分离［5］。结合本文MTT法结果可以知道，较晚洗脱出来的流分D，对人脐静脉血管内皮细胞具有促进增殖生长作用，推测流分D中促进血管内皮细胞生长的物质可能与含有酚羟基数目较多有关。但要确定酚羟基是否为促人脐静脉血管内皮细胞生长的药效团有待进一步研究。
血管内皮细胞在维持血管张力和血流调节方面发挥重要作用，内皮细胞还可以阻止血小板和白细胞的激活，所以完整的内皮系统在维持血管稳定和防止血栓方面发挥重要作用。临床实践证实中药何首乌提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用。本实验结果表明，在何首乌醇提物的正丁醇萃取物中含有对血管内皮细胞增殖产生促进作用的活性物质，可使细胞的分裂相增多，染色质丰富，为进一步从何首乌中分离纯化具有保护和修复血管内皮细胞的活性物质提供了依据。
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【摘要】 为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物学特性和支持造血能力的影响，采用常规方法分离培养骨髓MSC，将传代后的细胞用含10％二甲亚砜、40％胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中，观察短期（4周）和中期（9-15月）复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同冻存前的MSC进行比较。 结果表明：中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)％和(93士2.51)％；冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生长作用和冻存前MSC相似。结论：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，细胞活性略有下降，但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。
【关键词】 支持造血
Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation
Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.
Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果［1-4］。将培养后的MSC冻存，在患者需要MSC治疗时给予输注，具有很好的临床应用前景。但是，冻存是否会影响MSC的生物学特征，我们尚不清楚。因此，本研究将骨髓来源的MSC冻存于-196℃液氮中，观察中期和短期冻存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同冻存前的MSC进行比较，为进一步在临床中的应用提供详尽的实验依据。
材料和方法
试剂
IMDM、DMEM、DF12、MCDB培养液、胎牛血清、马血清和甲基纤维素均为Gibco公司产品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗体购自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3购自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式维甲酸、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）和二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司。
MSC的分离和培养
骨髓来自8例健康志愿者（年龄18-34岁，平均29岁）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴细胞分离液（密度1.077）400×g 离心20分钟，取白环以上细胞部分，计数后接种于含40% MCDB、2% FCS的DF12培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，24小时后换液，去除未贴壁细胞。当细胞达到70%融合时，常规消化传代。
MSC的冻存和复苏
将1×106细胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，总体积1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天转入-196℃中冻存。将中期9-15个月（平均13个月）和短期（4周）冻存的MSC置于37℃水浴中快速复温，冻融后加入8 ml IMDM混匀后离心，然后再用IMDM洗涤1次，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。第2天，更换新鲜培养液。
细胞活性和增殖能力测定
应用台盼蓝拒染回收率（TBR）试验检测复苏细胞的活性，TBR(%)＝冻存后活细胞计数/冻存前活细胞计数×台盼蓝拒染率×100％。将冻存前后的MSC接种在24孔板中（5×103细胞/孔），置37℃、5% CO2培养箱中培养，每隔1天取2孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。
细胞免疫表型分析
用含20 g/L BSA的PBS将胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的细胞悬液。每个上机试管中加入500 μl细胞悬液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR单克隆抗体，同时设空白对照，于4℃孵育30分钟，PBS洗3遍。再加入FITC标记的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分钟，PBS洗4遍，用流式细胞仪检测。使用cellquest软件获取并分析数据。
体外诱导多向分化检测
成骨诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，3周后应用von Kossa染色检测钙化小结。
脂肪诱导 将5×104细胞接种于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L维生素C和10% FCS的IMDM，7天后油红O染色检测脂肪滴。
支持造血的能力测定
将冻存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ线照射，然后更换为长期培养液（含12.5％ FCS、 12.5%马血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氢化考的松的IMDM）。获取健康人骨髓单个核细胞，预先培养4小时以去除贴壁细胞，将悬浮细胞按照1×106/ml接种在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2条件下培养，每周半量换液。4周后获取全部细胞接种于甲基纤维素体系中测定其集落形成能力。培养体系为: IMDM中含30%马血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巯基乙醇、1%甲基纤维素和重组细胞因子。细胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成实验在24孔培养板中进行，于37℃、5% CO2条件下培养14天。每孔接种1×106个细胞。14天后在倒置显微镜下计数集落，50个以上细胞为1个集落。
统计学分析
采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验数据用平均值±标准误表示，组间比较应用方差分析。
结 果
骨髓MSC的形态特征和生长特点
于倒置显微镜下，冻存前骨髓MSC为成纤维样，胞浆丰富，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。根据细胞生长曲线，骨髓MSC的倍增时间约为42.03士2.41小时。细胞形态和倍增时间随着细胞传代并不发生改变。
冻存后MSC的活性率和增殖能力
骨髓MSC的活性率（TBR）随着冻存时间的延长略有下降。短期冻存MSC的TBR为93士2.51％；中期冻存MSC的TBR为90士3.75％。二者之间并没有显著性差异。冻存后MSC的增殖能力同冻存前相比较，没有明显差异。依据生长曲线可以得出短期和中期冻存后骨髓MSC的倍增时间分别为39.54士3.53小时和41.64士1.68小时。
冻存前后MSC的免疫表型
通过流式细胞仪检测冻存前后骨髓MSC的免疫表型发现，冻存前后MSC均表达CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性(表1)。CD分子的表达量在冻存前后略有不同，但均不存在显著性差异。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）
多系分化的鉴定
成骨分化 2周后细胞聚集成集落，并有少量钙盐沉积，继续培养1周，细胞呈现多层生长的结节状，并有大量钙盐沉积，而对照组细胞仍为单层生长，无钙盐沉积。von Kossa 染色证实为钙盐沉积(图A)，对照组无上述现象出现。
成脂肪分化 3-5天后发现少量细胞中有小脂肪滴出现，继续诱导，1周后可以看见大部分细胞胞体变大，胞浆出现大量脂肪滴，油红O染色证实为脂肪滴(图B)，而对照组细胞胞浆中无脂肪滴出现，油红O染色为阴性。
冻存后的MSC同样具有成骨和成脂肪分化能力(图C，D)。
支持造血作用
为了评估冻存是否影响MSC支持造血的能力，将骨髓单个核细胞接种于照射过的冻存前和复苏的MSC中，在长期骨髓培养液中培养4周后检测CFU生成情况。如表2所示，冻存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的产率在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC为滋养层的骨髓长期培养体系中并无显著性差异。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）
讨 论
MSC是造血微环境中主要组成部分，通过合成、分泌多种造血因子和黏附分子来调控造血干细胞的增殖、分化和自我更新。既往研究显示，MSC可以合成并分泌多种造血细胞生长因子，具有维持长期培养起始细胞(LTC-IC)的能力，促进造血干细胞的增殖和分化［5］。联合MSC的移植方案还可以促进HSC的植入和移植后的造血恢复［6］。但是，在体外培养扩增中，MSC的增殖能力会逐渐下降并发生分化，支持造血的能力减弱。将扩增后或者增殖旺盛的MSC进行冻存，在需要的时候复苏培养，可以有效地解放上述问题并确保提供足够的MSC应用于临床。
既往的大量研究显示，造血干细胞可以在液氮中长期冻存，复苏后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC经过低温冻存和复苏，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影响，尚不明确。因此，我们观察了骨髓MSC经过短期（4周）和中期（9-15月）冻存后的生物学特性和支持造血能力。结果显示，经过中期和短期冻存后MSC的形态并未发生改变，仍为梭形，贴附在培养瓶底。冻存后MSC的活性略有下降，但冻存并不影响细胞的增殖能力，冻存前和中期、短期冻存后MSC的倍增时间在40小时左右，经统计学分析不具有显著性差异。通过FACS检测，冻存前后的MSC的免疫表型没有明显改变，表现为CD29、CD44和CD105为阳性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR为阴性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我们将经过中期和短期冻存后MSC诱导向脂肪和骨分化，结果显示冻存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且这种分化能力，并不随着复苏后细胞的传代而发生变化。由此可见，中期和短期冻存并不影响MSC的生物学特性。
支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，冻存后MSC支持造血能力是否发生变化将直接影响MSC的临床应用。Majumdar等［7］的研究显示，骨髓MSC可以分泌多种造血生长因子，具有支持造血作用，能促进骨髓来源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是冻存后MSC支持造血能力如何变化，既往并无报道。在本实验中，我们通过检测体外长期培养体系中集落形成情况来评估冻存后MSC对造血干细胞的支持作用。骨髓单个核细胞在以冻存前、短期冻存和中期冻存后MSC作为滋养层的骨髓长期培养体系中培养，4周后的骨髓单个核细胞的CFU生成率在各体系之间没有显著性差别。这说明经过中期和短期冻存后MSC仍具有支持造血能力，同冻存前比较，支持造血能力没有明显变化。进一步分析上述不同培养体系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情况，结果表明：冻存前后MSC均可以促进CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促进定向祖细胞的增殖能力在冻存前后没有明显差别。这些结果表明，冻存并不影响MSC促进不同阶段造血祖细胞增殖、分化的能力。
综上所述，本研究通过体外实验初步证实：经过中期和短期低温冻存的骨髓MSC并不改变其固有的生物学特性。虽然冻存可以导致部分细胞损伤，但是并不影响剩余细胞的增殖能力和多向分化能力。此外，冻存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，冻存后MSC是否在体内仍具有上述生物学性状和支持造血功能，尚需进一步研究证实。
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[关键词]血管;组织工程;细胞外基质;生物力学
[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)07-0996-04
Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery
LIU Guo-feng1,HE Zhi-juan2,YANG Da-ping1,XU Xue-wu1,LIU Ying1,REN Li-hong1,LI Qing-chun1
(1.Department of Plastic Surgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 15001 0,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (H&E) staining,quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength, burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery, decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.
Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical
血管组织工程学研究为临床上小口径血管移植物的制备提供了光明的前景,口径小于6mm的小口径组织工程血管研究与大口径血管移植物的研究有很大的差别[1]。因为血管移植物与受区血管生物力学性质的匹配程度对不同口径的组织工程血管移植物通畅率的影响差别较大,血管移植物的口径越小受到的影响越大,小口径血管移植物在受体内更容易发生内膜增生、中膜增厚,最后导致移植物的官腔狭窄甚至闭塞[2]。血管组织工程研究中支架材料的力学性质对血管移植物的生物力学性质起着决定性的作用,所以在小口径组织工程工程血管的研究中制备与受区血管生物力学性质完全匹配的支架材料是最关键的科学问题,这将决定小口径组织工程血管移植的远期通畅率[3]。本实验将对小口径组织工程血管脱细胞基质生物支架材料的生物力学性质进行研究,明确生物酶联合消化法对犬颈总动脉脱细胞基质材料生物力学的影响。
1材料和方法
1.1 实验用动物:普通杂种家犬,体重25～30kg,6个月龄,雌雄不限。
1.2 实验材料及主要仪器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脱氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease,DNase):美国Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer solution,PBS):北京中杉生物公司;普通光学显微镜:日本Nikon公司;S-3400N型扫描电子显微镜:日本Hitachi公司;电子万能实验材料机:德国Zwick-Roell公司。
1.3 犬颈总动脉脱细胞基质材料制备: 无菌条件下切取犬颈总动脉,大量无菌PBS冲洗,去除血液成分及外层附属软组织,选择切取长度约为7cm,内径约为3mm的动脉,利用胰蛋白酶和核酸酶连续消化法去除动脉细胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h,中间更换1次消化液,大量PBS冲洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h,大量无菌PBS 溶液冲洗。以上步骤均在5%CO2、37℃,80次/ min持续震荡条件下进行。监测制备的脱细胞血管基质,使材料的细胞DNA残留量少于0.1%。同时选取新鲜犬颈总动脉作为对照组(每组6例),进行以下检测。
1.3 组织学染色 将标本置于10%中性甲醛溶液中固定24h,常规石蜡包埋、切片,进行HE染色。在普通光学显微镜下对标本的结构进行组织学评价照相。
1.4 扫描电镜观察 将标本在1%戊二醛溶液中固定24h以上,用1%饿酸作后固定2h,50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水,50%、70%、90%、100%醋酸异戊酷置换,应用临界点干燥仪、液体C02等进行干燥;干燥的标本固定在铝质标本台上,用溅射镀膜机镀金后,用S-3400N型扫描电子显微镜系统观察并照相。
1.5 生物力学检测:利用Zwick/Roell Z010型电子万能力学实验机测定标本的拉伸强度、爆裂强度及轴向顺应性。拉伸强度及轴向顺应性检测:将管状标本(长度为5cm)两端固定于微型夹具上,以0.5mm/s的速度拉伸,直至标本断裂,系统自动记录标本的应力-应变曲线及极限拉伸强度,计算出标本的轴向顺应性。爆裂强度检测:把管状标本一端用丝线结扎,另一端固定于装满生理盐水的5ml医用注射器上,注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中,整个装置平置在力学实验机上,以40kPa/s的力向标本内注射生理盐水,直至标本爆裂或漏液,系统自动记录标本的爆裂强度。
1.6统计学分析: 所有定量实验结果均用x±s表示,利用SPSS11.0统计学软行独立样本t检验,P
2结果
2.1大体所见:犬颈总动脉脱细胞基质材料仍保持新鲜血管的管状结构,血管的长度及内径无明显改变,材料外观呈乳白色(图1)。
2.2 组织学结构:新鲜犬颈总动脉具有血管典型的三层结构:内膜、中膜及外膜,中膜层较厚,包含大量的环状排列蓝染的细胞核成分和细胞外基质成分(图2A)。经脱细胞处理后,血管壁中的蓝染的细胞核成分全部去除,但脱细胞血管的细胞外基质中纤维成分保存完整连续,没有发生断裂破碎等。血管的中膜层结构中可见细胞及部分细胞外基质去除后遗留的空隙,同时血管内外膜结构的细胞外基质成分保持完好(图2B)。
2.3 扫描电镜观察:脱细胞犬颈总动脉脱细胞基质横断面的扫描电镜照片可见大致的三层细胞外基质结构,内层见完整致密的内弹性膜,中层可见成层环状排列的纤维板层结构,纤维连续,可见梭形空隙,材料外层可见杂乱排列的外膜层纤维条索组织(图3A)。材料内表面扫描电镜照片显示,材料的内弹性膜纤细的纤维呈网状分布,纤维完整,未见明显断裂缺失,透过纤维网可见深部中膜层较粗大的纤维(图3B)。
2.4 生物力学性质:爆裂强度检测结果如下,脱细胞犬颈总动脉基质组为315.00±12.49 KPa,新鲜犬颈总动脉组为330.52±18.73 KPa,两组标本爆裂强度相似,差别无统计学意义(P>0.05)(图4)。极限拉伸强度检测结果如下:脱细胞犬颈总动脉基质组为4 122.91±118.05 KPa,新鲜犬颈总动脉组为4 212.99±103.80 KPa,两组标本极限拉伸强度相似,差别无统计学意义(P>0.05)。轴向顺应性计算结果如下,脱细胞犬颈总动脉基质组为0.945±0.158 mm/mm,新鲜犬颈总动脉组为1.195±0.22 mm/mm,脱细胞犬颈总动脉基质组轴向顺应性低于新鲜犬颈总动脉组,差别有统计学意义(P
3讨论
具有三维空间结构的支架材料是构建组织工程血管的基本要素之一,能为血管种子细胞生长和组织发育提供临时的支撑骨架,并能够调控所构建血管的形态。研制和开发理想的支架材料仍然是血管组织工程所面临的巨大挑战。为了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足,很多学者把研究目光转移到了自然来源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性,能够促进细胞的黏附、生长、增殖及生物功能的发挥。血管组织工程支架材料的发展趋势是自然生物材料的应用,自然生物材料是最有应用潜力的组织工程支架材料来源[6]。血管脱细胞基质材料的三维空间结构与自然血管的结构非常类似,因此具有理想的外形和适当的生物力学性质,是血管组织工程学研究中较为理想的生物支架材料[7]。
正常血管的细胞外基质成分包含胶原纤维、弹性蛋白及蛋白聚糖等成分,胶原纤维及弹性蛋白对于血管的强度起关键性的作用。胶原纤维具有良好的抗张强度,对于维持血管的完整性具有重要意义,弹性蛋白和蛋白聚糖有一定的弹性,能够使血管具有良好的顺应性[8]。研究表明,脱细胞处理会改变血管原有的生物力学性质,特别是材料的顺应性常会降低[9]。本实验利用生物酶连续消化法制备的犬颈总动脉脱细胞基质材料在去除了细胞及DNA残留物的同时,细胞外基质的纤维成分保持完整连续,所以脱细胞材料的拉伸强度和爆裂强度与新鲜血管相似。除胶原纤维和弹性蛋白等细胞外基质纤维成分外,蛋白聚糖成分在脱细胞处理过程中常会遭到破坏,蛋白聚糖的去除对于脱细胞血管的拉伸强度和爆裂强度没有明显的影响,但会使材料的弹性降低变硬,生物力学的表现是材料的顺应性下降[10]。本实验的结果也证实了这一点,经过生物酶连续消化脱细胞处理,脱细胞犬颈总动脉基质材料的轴向顺应性有所降低,从组织学观察可以看出,脱细胞后血管横断面胶原纤维和弹性蛋白等纤维条索中间出现很多梭形空隙,这些空隙是由于中膜内平滑肌细胞及蛋白聚糖的去除而形成的,因此,脱细胞犬颈总动脉的轴向顺应性与新鲜血管相比有所降低。
组织工程血管的拉伸强度、爆裂强度的顺应性是重要的生物力学力学评价指标,足够的拉伸强度和爆裂强度能够保证血管移植后能够抵抗长期的血液动力学作用而不形成动脉瘤。而对于小口径组织工程血管移植物,顺应性与拉伸强度和爆裂强度相比显得更为重要,小口径血管移植物和受区血管之间的顺应性要匹配,这是移植物长期成功的重要保证[11-12]。血管移植物与受区血管之间的顺应性等力学性质错配会导致血流动力学的变化,血流方向改变、剪切力增加、下游血流紊乱、循环张力改变,从而引起吻合口处的应力集中,刺激内膜增生的生长因子的释放增加,促进了血栓的形成和新内膜的增生,最终导致血管移植物长期通畅率明显降低[13-14]。脱细胞处理经常会导致血管细胞外基质材料顺应性的降低,从而影响构建的小口径组织工程血管与受区血管生物力学性质的匹配,导致移植失败,所以提高以脱细胞血管基质为支架材料的小口径组织工程血管的顺应性是组织工程血管研究的瓶颈问题。可能的解决方案包括:(1)改进完善脱细胞血管基质材料的制备方法,在保证血管细胞成分完全去除的前提下尽量保留细胞外基质材料原有的生物力学性质;(2)通过在脱细胞血管基质材料上复合某种其他材料制备顺应性良好的复合支架材料;(3)在体外利用脱细胞血管支架材料构建组织工程血管的过程中促使平滑肌细胞分泌大量新生细胞外基质成分,以增加组织工程血管的顺应性。
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一、精选教材
教材是课程知识内容的载体，是进行教学活动的基本材料之一[2，3]。如何选择和使用教材对教学任务的实施、完成和对教学质量的影响至关重要。通过对相关院校的走访、大量资料的查阅以及结合本校水产养殖学科的专业特点、课程学时数以及授课对象，最终确定以翟中和等主编的《细胞生物学》为教学用教材，并及时跟进该书的新版本。在应用该教材的同时，特别注重其他教科书的参考和补充，如将王金发编著的《细胞生物学》、王堃仁等主编的《细胞生物学》、郑国锠等主编的《细胞生物学》、Alberts主编的《Molecular Biology of the Cell》等作为本课程的参考教科书。此外，教师在备课过程中还注重寻求教科书之外的教学资源，如国内外重要学术期刊、国内外知名大学《细胞生物学》课程网站，特别是国外互联网站上与细胞生物学知识相关的网络资源。教学中将教材、参考教科书以及教科书之外的教学资源相互补充和凝练，力求教学内容的系统性和前瞻性。
二、教学内容的遴选
《生物化学》、《遗传学》、《细胞生物学》和《生理学》等是水产学院重要的学科基础课。这些课程在内容上联系极为密切，相互交叉和渗透。在《细胞生物学》课程的教学中，既要避免本课程与其他课程内容的过度重复又要保证授课内容的完整性、体现细胞生物学的核心内容。根据水产学院的教学安排以及授课学生的实际情况，在《细胞生物学》理论课教学中对所用教材的内容进行遴选，合理取舍与合并，最终形成十章作为本校水产养殖学科《细胞生物学》理论课教学内容，即：“绪论”、“细胞的基本知识”、“细胞生物学的主要研究方法”、“细胞表面”、“细胞基质和内膜系统”、“线粒体”、“细胞骨架”、“细胞核与染色体”、“细胞周期和细胞的分裂与分化”和“细胞的衰老与凋亡”。《细胞生物学》理论课的教学内容遴选后，授课中以细胞的结构和功能为主线，从显微、亚显微和分子水平阐述细胞结构，特别是结构与功能的相关性，认识细胞重要生命活动的基本内容和本质，掌握细胞生物学的基本概念和基础理论，在《生物化学》、《遗传学》和《生理学》课程学习的基础之上，通过《细胞生物学》的教学，使学生的知识体系更加系统化、深入化。
三、调整与优化教学内容，因材施教，提高教学效果
由于课堂教学仍然是在校学生获取知识的主要形式[4]，因此教学内容确定后，教师要梳理每一章的教学内容，清晰讲授的重点和应达到的具体教学目的。首先，教师要意识到第一次课的重要性，它对激发学生的学习兴趣有着重要的作用。与其他课程一样，课程的讲授内容通常以绪论开篇。但是，不仅许多学生不重视绪论的内容，教师也容易出现缺乏对绪论讲授的激情[5]。教学中我们将教材[1]中绪论的内容重排、调整与优化，收到了较好的教学效果。授课中将细胞生物学的发展简史作为最先讲授的内容，并结合一些与之相关的逸闻趣事，激发学生对该门课程学习的兴趣，使学生在轻松的氛围中了解学科的诞生、认识学科的发展与实验仪器和技术进步的关系；通过介绍“细胞学说”的建立，不仅使学生掌握了该学说的基本原理，还使学生意识到善于点滴积累以及归纳和总结对学习和工作的重要性，通过上述学习学生们也弄清了细胞生物学最基本的研究内容。之后再介绍当今细胞生物学的主要研究内容和研究热点，并将教材目录与绪论的内容相联系，这样不仅使细胞生物学的研究内容深记于学生的脑海中，也便于他们对本课程后续内容的学习和提高学习的信心。其次，授课内容的顺序编排要便于学生与已掌握的有关知识相衔接。根据授课对象的实际情况，教学中按着细胞的组织结构从外向内，即：细胞表面→细胞质→细胞核的顺序，并将结构或功能上联系极为密切的细胞结构的知识放在一起讲授。以本课程的“细胞表面”与“细胞基质和内膜系统”两章为例，对教材以及相关的教科书中的有关内容做了较大的调整，重新编排与优化。授课时“细胞表面”一章，首先介绍细胞表面的结构组成（质膜、细胞外基质和细胞外被、细胞表面的特化结构细胞连接），各结构的特点、功能以及这些结构的相互关系；通过这样的讲授使学生清楚地知道多细胞生物中虽然所有的细胞都具有“质膜”这样一个界膜，它是细胞表面核心结构，但多细胞生物不仅由细胞构成，细胞外还有细胞外基质，同时没有一个细胞是孤立的，细胞与细胞或与细胞外基质形成特定的组织连接结构，从而使多细胞生物成为一个和谐的统一体。之后再详尽地介绍细胞表面核心结构——质膜的物质的运输和信号转导功能，通过这部分的学习又使学生对膜的不对称性和流动性有了更好的理解。此外，由于核糖体与内质网在功能上的关系极为密切，因此将核糖体并入内膜系统中介绍，形成本课程的“细胞基质和内膜系统”一章。授课中首先讲解非膜性细胞器——核糖体在细胞中的分布、化学组成和结构以及功能，之后介绍内膜系统中的内质网、高尔基体和溶酶体的超微结构与功能，但内质网和高尔基体的蛋白质加工功能与蛋白质的分拣形成本章独立的一节，即“蛋白质的分拣与加工”，内容包含信号假说、蛋白质的修饰与加工、蛋白质的分拣和膜泡运输，此节为本章的教学重点之一。介绍信号假说时，由于有了核糖体的知识基础，再结合具体的研究成果，学生则很容易理解分泌性蛋白的合成在细胞基质中起始、肽链延伸暂停、向内质网膜转移等信号假说的具体内容；通过本节其他知识内容的学习，清晰了蛋白质的修饰加工可发生在肽链的合成以及运输过程中，因此构成了蛋白质合成、加工与运输的完整体系。此外，将溶酶体的发生也独立成节，放在“蛋白质的加工与分拣”一节之后，以溶酶体酶的M6P分拣途径为例，将信号假说、蛋白质的加工与分拣以及膜泡运输的部分内容串联起来。通过上述讲授内容的遴选、调整与优化，也使学生对结构、功能、发生上相互关联的内膜系统的理解更加透彻。再次，根据教学时数适当安排自学与课后讨论的教学内容，培养学生自主和探究学习的能力。如“细胞生物学的主要研究方法”一章，不可能在有限的学时内将该部分内容讲透彻，因此该部分内容以学生自学、课下参观相关的仪器设备及与教师交流讨论的形式实现学生对该部分知识的获取；此外根据授课专业特点，叶绿体的知识也以学生自学和课下与老师交流的方式进行。最后，注重讲授内容与其他课程内容上既不过度重复又要较好地衔接。如在讲授质膜的功能——钠钾泵的知识时注意与《生理学》膜电位的知识相联系、细胞骨架中微丝的功能时注重与《生理学》以及《组织胚胎学》肌肉收缩内容的衔接，线粒体功能的讲解则考虑与《生物化学》的内容不过度重复和较好的衔接，而细胞核与染色体的知识需要考虑学生在《遗传学》课程上已掌握的知识。由于本课程的开设在上述几门课程之后，这就要求我们与上述课程的任课教师以及授课学生良好的沟通，适当调整本课程的授课内容与重点，从而使学生通过《细胞生物学》课程的学习，使他们知识体系更加系统化、深入化。
由于细胞生物学的知识面广、信息量大、发展快，因此教学内容的改革是教学改革最重要的部分。结合我校水产养殖学科的专业特点和授课对象的实际情况，对《细胞生物学》理论课的教学内容进行遴选、调整重排与优化，并且应用于《细胞生物学》的教学中，提高了教学效果。此外，通过多年的教学实践我们深深地体会到，完成好教学内容，教师尤其要注重自身知识理论水平的提高，不断地丰富教学内容，才能不断提高教学效果与教学质量。
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