发布时间：2024-02-21 14:41:57
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[中图分类号] R631 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）25-22-03
Study of Toll-like Receptor Gene Polymorphism in Sepsis
WANG Zhiyi SUN Laifang
Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Sepsis is defined as the systemic inflammatory response of the body to an infection. Numerous studies show that the susceptibility and clinical outcome of sepsis associated with the different genetic background. This review summarizes the research on relationship between the sepsis and Toll-like receptor gene polymorphisms.
[Key words] Toll-like receptors；Gene polymorphisms；Sepsis
脓毒症是感染引起的全身性炎症反应综合征，是创伤、烧伤、术后感染和危重病的常见并发症，可进一步发展成严重脓毒血症、脓毒性休克和器官功能障碍综合征，甚至死亡。流行病学调查显示[1]，脓毒症的发病率和死亡率随年龄的增长而增加，且黑人脓毒症易感性比白人高，死亡率也明显高于其他人种，可见机体的遗传因素对脓毒症的易感性和临床转归具有重要的作用。为进一步证实遗传因素对脓毒症的作用，2001年国际脓毒症定义会议建议将遗传背景因素作为脓毒症病因的重要组成部分进行研究。近年来，国内外对脓毒症的基础与临床研究十分重视，大量研究表明Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）与脓毒症的发病机制有关[2]。本文就脓毒症与TLRs基因多态性研究作如下综述。
1Toll样受体
TLRs是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蝇胚胎发育过程中发现一个决定果蝇的背腹侧分化的基因，将其命名为Toll基因。目前，在人类中已经发现的TLRs家族成员有11个，根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，可分为5个亚科，即TLR2（包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10）、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9（包括TLR7、TLR8和TLR9）。TLRs结构包括胞外富含亮氨酸的重复序列（LRR），跨膜区，胞内Toll/IL-1受体结构域。TLRs介导的信号途径包括激活NF-κB、MAP激酶、干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs），从而释放细胞因子、化学增活素、干扰素与免疫球蛋白，在宿主防御免疫反应方面起着重要作用。1997年，Medzhitov等报道了与果蝇同源性的人类Toll，当其过多表达时可活化NF-κB，并诱发刺激分子表达[3]。
2TLRs基因多态性与脓毒症
基因多态性是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中的出现频率皆高于1％，是人体对疾病易感性与耐受性、临床表型多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。研究发现TLRs、肿瘤坏死因子TNF等炎症因子、丝裂原活化抑制因子（PAI-1）、人白细胞抗原（HLA）和热休克蛋白（HSP-70）等基因多态性均与脓毒症有关。目前，研究较多的是TLRs基因多态性。
2.1 TLR4基因多态性与脓毒症
Poltorak等[4]和Qureshi等[5]用遗传学方法发现，携带C3H/HeJ和C57BL/lOScCr基因的两株小鼠表现为对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）高度耐受性和对革兰阴性菌感染高度易感性。前者为TLR4基因第3外显子的错义突变致TLR4基因编码产物多肽链第712位上的脯氨酸被组氨酸所取代，后者为TLR4基因存在无义突变。这种基因突变或多态性解释了同种个体间对脓毒症易感性的差异和不同种属对部分脂多糖结构反应不同，表明TLR4基因是调节LPS反应的关键。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究是最常见的基因组学研究方法。目前对TLR4的SNP研究主要集中在Asp299Gly（299位天门冬氨酸与甘氨酸的置换）和Try399Ile（399位苏氨酸与异亮氨酸的置换）2个位点的突变。Arbour等[6]通过转染Th.1细胞发现Asp299Gly位点的突变可干扰TLR4介导的LPS信号转导通路，降低呼吸道上皮细胞对人LPS的刺激反应性。Agnese等[7]研究表明Asp299Gly/Thr399Ile突变可是使革兰氏阴性菌感染发生率明显升高。Lorenz等[8]发现单纯Asp299Gly多态性只存在于感染性休克患者中，且有等位基因TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile的患者易发生革兰阴性菌感染。Barber RC等[9]研究发现，烧伤患者TLR4的Asp299Gly突变可增加其发生严重脓毒症的危险性。Shalhub等[10]认为TLR4基因的突变与创伤后脓毒症的严重性相关，并认为这种相关性可能不仅是由Asp299Gly单核甘酸多态性引起的，也可能与TLR4其他位点的突变协同导致。
以上研究表明TLR4基因多态性与脓毒症的发生、发展有密切关系，但也有不少研究得出阴性结果。Jessen等[11]研究显示，TLR4的基因多态性与革兰氏阴性菌引起的脓毒症无明显相关性。Feterowski等[12]对多种微生物感染引起的术后脓毒症进行研究，结果显示脓毒症的发生率及死亡率与TLR4位点的突变无相关性。Kumpf[13]，Taudoff[14]等认为Asp299Gly与Thr399Ile的突变与脓毒症细胞因子的变化无明显相关性。国内学者也有类似报道[15]，单小鸥等[16]研究发现TLR4基因（Asp299Giy、Thr399Ile）多态性与温州地区汉族儿童脓毒症易感性无明显相关性。因此，TLR4基因多态性与脓毒症相关性及参与因素的影响仍有待进一步研究。
2.2TLR2基因多态性与脓毒症
TLR2是TLRs家族中的主要成员之一，是宿主防御细菌、真菌及病毒感染的识别受体。目前已发现TLT-2基因存在两种多态性：Arg753Gln（TLR-2-Ⅰ）和Arg677Trp（TLR-2-Ⅱ）。前者与脓毒症的发生有关，后者与瘤型麻风的发生有关[17]。研究表明，TLR2基因敲除小鼠对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的易感性明显增强，对螺旋体的易感性也较野生型的高[18]。Lorenz等[19]对91例脓毒症休克患者进行TLR2基因分析，发现2例患者具有Arg753Gln多态性，且都伴有金黄色葡萄球菌感染。Thuong等[20]对358名越南结核患者研究发现，TLR2基因多态性与肺结核和结核性脑膜炎的易感性有关。以上研究表明，TLR2基因的变异可能增强机体对致死性细菌的易感性。而Moore CE等[21]对420例金黄色葡萄球菌感染患者进行研究，结果显示TLR2的Ar9753Gln基因多态性与机体对金黄色葡萄球菌的易感性和严重程度不相关。宋振举等[22]研究也显示，TLR2基因多态性与中国汉族人群的重症社区获得性肺炎易感性和预后无明显相关性。因此，TLR2基因多态性与脓毒症的确切关系尚需进一步的研究证实。
2.3TLR5基因多态性与脓毒症
TLR5在细菌鞭毛诱导的炎性反应中起核心作用。Lissauer等[23]研究表明，脓毒症患者TLR5的表达较正常人群显著增高。TLR5基因内存在3个频率较高的编码性单核苷酸多态性位点。其中两个错义多态性位点592N（rs2072493）和L616F（rs5744174）位于TLR5的胞外区，为引起氨基酸发生改变的SNP位点。另一个多态性位点R392X（rs5744168）是无义突变，可引起11LR5的跨膜结构域和胞内部分的完全缺失，该位点与发生军团菌引起的肺炎的高风险相关[24]。以上研究表明LR5很可能是脓毒血症的易感基因，其遗传学变异可能会影响TLR5的功能。而王志富等[25]对中国255例脓毒症患者和260例对照个体的3个cSNP（rs5744168，ra5744174和rs2072493）进行研究，结果显示以上3个导致氨基酸发生改变的SNP位点与脓毒血症的易感性和严重程度无显著关联，但不排除其它未进行研究的TLR5基因多态性可能会影响脓毒血症的发生、发展和转归。
2.4Toll样受体基因多态性的种族差异对脓毒症的影响
在TLRs基因多态性与炎性应答损伤的遗传易感性研究中，不同种族及地区的研究结果往往不同。通过对比中国汉族与其他种族TLR4基因的Asp299GIy、Thr399Ile和TLR2基因的Ar9753Glu、Ar9677Trp多态性分布，发现不同种族及地区人群的等位基因频率及基因型频率的分布有差异。吕欣等[26]检测了健康汉族人群及缺血性卒中患者DNA样本，未发现Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性。Hang等[27]也认为TLR4基因编码区Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性在中国人群中非常罕见。其他类似研究也表明中国浙江汉族人[28]、中国湖北汉族人[29]与日本人的等位基因频率及基因型频率相似，均未检测到TLR4基因Asp299Gly、TLR2基因Ar9753Glu和Ar9677Trp的突变位点，而德国人TLR4基因的Asp299Gly突变频率5.6％、Ar9753Glu突变频率9.4％，西班牙人Ar9753Glu突变频率1％[30]，突尼斯人Ar9677Trp为31％[31]。lorenz等[8]、Agnese DM等[32]、Read等[33]分别调查了73例美国人、39例美国人、879例英国人和80例苏格兰人（均为健康白种人），发现Asp299Gly携带者的比例分别为13％，11％，10.5％，10％。据Smirnoval等[34]统计，欧洲人种多为Asp299Gly/Thr399Ile单倍型，Asp299Gly单倍型在非洲人中出现频率更高，在亚洲人中这2种突变均极为罕见，也证实了大部分研究中出现这2处基因突变的人群都为白种人或非洲人。
3结语
尽管有大量研究表明Toll样受体基因多态性与脓毒症的发生、发展有关，但仍需进一步研究证实。通过不同遗传背景人群的研究，可以初步推测我国汉族人群中TLR4基因多态性Asp299Gly携带者的比例较西方白种人低。TLRs基因多态性的种族差异研究使我们认识到遗传背景的不同可能会影响其基因多态性在感染性疾病发病中的作用。为脓毒血症临床诊疗提供新的思路、方法和途径。
[参考文献]
[1] Hodgin KE，Moss M. The epidemiology of sepsis[J]. Curr Pharm Des，2008，14（19）：1833-1839.
[2] 陈颖炜，郑捷．Toll样受体的研究进展[J]．上海医学，2008，31（4）：298-300．
[3] Medzhitov R，Preston-Hurlburt P，Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature，1997，388（6640）：394-397.
[4] Poltorak A，He X，Smirnova I，et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice：mutations in Tlr4 gene [J]. Science，1998，282（5396）：2085-2088.
[5] Qureshi ST，Lariviere L，Leveque G，et al. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4（Tlr4）[J]. J Exp Med，1999，189（4）：615-625.
[6] Arbour NC，Lorenz E，Schutte BC，et al. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans[J]. Nat Genet，2000，25（2）：187-191.
[7] Agnese DM，Calvano JE，Hahm SJ，et al. Human toll-like receptor 4 mutations but not CDl4 polymorphisms am associated with an increased risk of gram-negative infections[J]. J Infect Dis，2002，186（10）：1522-1525.
[8] Lorenz E，Mira JP，Frees KL，et al. Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with gram-negative septic shock[J]. Arch Intern Med，2002，162（9）：1028-1032.
[9] Barber RC，Chang LY，Arnoldo BD，et al. Innate immunity SNPs are associated with risk for severe sepsis after bum injury[J]. Clin Med Res，2006，4（4）：250-255.
[10] Shalhub S，Junker CE，Imahara SD，et al. Variation in the TLR4 gene influences the risk of organ failure and shock posttrauma：a cohort study[J]. J Trauma，2009，66（1）：115-122.
[11] Jessen KM，Lindboe SB，Petersen AL，et al. Common TNF-alpha，IL-l beta，PAI-l， uPA，CDl4 and TLR4 polymorphisms are not associated with disease severity or outcome from Gram negative sepsis[J]. BMC Infect Dis，2007，18（7）：108.
[12] Feterowski C，Emmanuilidis K，Miethke T，et al. Effects of functional Toll-like receptor-4 mutations on the immune response to human and experimental sepsis[J]. Immunology，2003，109（3）：426-431.
[13] Kumpf O，Hamann L，Schlag PM，et al. Pre-and postoperative cytokine release after in vitro whole blood lipopolysaccharide stimulation and frequent toll-like receptor 4 polymorphisms[J]. Shock，2006，25（2）：123-128.
[14] Taudorf S，Krabbe KS，Berg RM，et al. Common studied polymorphisms do not affect plasma cytokine levels upon endotoxin exposure in humans[J]. Clin Exp Immunol，2008，152（1）：147-152.
[15] 冯凯，周钢桥，翟芸，等．TLR4基因多态性在中国人群中的初步研究[J]．中华医学遗传学杂志，2005，22：99-101．
[16] 单小鸥，吴颖，叶碌，等．温州地区汉族儿童脓毒症与Toll样受体基因多态性[J]．中华儿科杂志，2010，48（1）：15-18．
[17] Schröder NW，Hermann C，Hamann L，et al. High frequency of polymorphism Arg753Gln of the Toll-like receptor-2 gene detected by a novel allele-specific PCR[J]. J Mol Med，2003，81（6）：368-372.
[18] Echchannaoui H，Frei K，Schnell C，et al. Toll-like receptor-2 deficient mice are highly susceptible to streptococcus pneumoniae meningitis because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation[J]. J Infect Dis，2002，186（6）：798-806.
[19] Lorenz E，Mira JP，Cornish KL，et al. A novel polymorphism in the toll-1ike receptor 2 gene and its potential association with staphylococcal infection[J]. Infect Immun，2000，68（11）：6398-6401.
[20] Thuong NT，Hawn TR，Thwaites GE，et al. A polymorphism in human TLR2 is associated with increased susceptibility to tuberculous meningitis[J]. Genes Immun，2007，8（5）：422-428.
[21] Moore CE，Segal S，Berendt AR，et al. Lack of association between Toll-like receptor 2 polymorphisms and susceptibility to severe disease caused by Staphylococcus aureus[J]. Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（6）：1194-1197.
[22] 宋振举，童朝阳，孙湛，等. TLR2基因单核苷酸多态性与重症社区获得性肺炎易感性和预后的关联研究[J]. 中国急救医学，2009，29（5）：389-392.
[23] Lissauer ME，Johnson SB，Bochicchio GV，et al. Differential expression of Toll-like receptor genes：sepsis compared with sterile inflammation l day before sepsis diagnosis[J]. Shock，2009，31（3）：238-244.
[24] Hawn TR，Verbon A，Lettinga KD，et al. A common dominant TLR5 stop codon polymorphism abolishes flagellin signaling and is associated with susceptibility to legionnaires’ disease[J]. J Exp Med，2003，198（10）：1563-1572.
[25] 王志富，周钢桥，方宇，等. Toll样受体5基因多态性与中国人群脓毒症的相关性研究[J]. 医学分子生物学杂志，2009，6（4）：325-330.
[26] 吕欣，愈卫锋，黄盛东，等．内毒索受体TLR4基因多态性“Asp299Gly”的分型检测[J]．第二军医大学学报，2004，25（11）：1195-1198．
[27] Hang J，Zhou W，Zhang H，et al. TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms are very rare in the Chinese population[J]. J Endotoxin Res，2004，10（4）：238-240.
[28] 蒋益，闵小彦，高劲松．Toll样受体4基因299位点A/G多态性与溃疡性结肠炎及大肠腺癌的关系[J]．长沙医学院学报（医学版），2007，12（25）：13-17．
[29] 谢志强，吕斌，邹立君，等．湖北人群Toll样受体4基因多态性研究[J]．华中科技大学学报（医学版），2004，33（5）：630-632．
[30] Sánchez E，Orozco G，López-Nevot MA，et al. Polymorphisms of toll-1ike receptor 2 and 4 genes in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus[J]. Tissue Antigens，2004，63（1）：54-57.
[31] Ben-Ali M，Barbouche MR，Bousnina S，et al. Toll-like receptor 2 Ar9677Trp polymorphism is associated with susceptibility to tuberculosis in Tunisian patients [J]. Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（3）：625-626.
[32] Agnese DM，Calvano JE，Hahm SJ，el al. Human Toll-like receptor 4 mutations but not CD14 polymorphisms are associated with an in-creased risk of gram-negative infections[J]. J Infect Dis，2002，186（10）：1522-1525.
[33] Read RC，Pullin J，Gregory S，et al. A functional polymorphism of Toll-like receptor 4 not associated with likelihood or severity of meningococcal disease[J]. J Infect Dis，2001，184（5）：640-642.
【关键词】肿瘤坏死因子;相关凋亡配体（FAS-670）; 基因多态性;胃癌
【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0134-02
细胞凋亡是一种基本的生物现象，并参与了各种生理功能，如在机体发育过程中或在某些病理过程，包括免疫系统疾病和肿瘤的发展，调节细胞数量和消除的有害或有潜在危险的细胞。FasL 系统在许多类型的细胞凋亡信号传导过程中扮演了重要角色。 Fas抗原是一个45 kDa的细胞表面蛋白，属于死亡受体家族的肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族。结合的Fas配体（ FasL ）的Fas抗原启动死亡信号级联反应，从而导致细胞凋亡。 Fas受体广泛表达在各种组织细胞上，但FasL表达仅限于细胞内的免疫系统，如激活T细胞和自然杀伤细胞，或免疫特异细胞，如眼睛和繁殖器官[1]。许多肿瘤细胞都已经被证明有Fas和FasL表达的改变。迄今为止，一些研究表明在许多人类恶性实体肿瘤，包括食管癌[2]和乳腺癌中，Fas出现下调。班尼特等人曾[3]报道了胃癌中存在FasL上调和肿瘤浸润淋巴细胞（淋巴细胞）凋亡。其他的一些研究也表明在人胃癌细胞腺瘤和癌能检测到许多凋亡细胞，及出现胃癌组织FasL上调，从而逃避宿主免疫攻击[4]。Fas基因已被确定位于染色体10q24.1区域，而FasL基因位于染色体1q23，两个潜在功能多态性（即白细胞介素-1B-511T和IL-1RN第2/2）被认为与幽门螺旋杆菌感染与IL-1β的表达有关，由此可能增加了发生各肿瘤的风险。但研究胃癌患者和其Fas FasL基因多态性的之间关系还未见报道。
1 材料与方法
1.1 研究对象
（1）胃癌组 171例胃癌患者来自2001年12月～2005年12月武汉大学中南医院门诊和住院患者，所有病例均经我院组织病理学证实为胃腺癌，采样前未进行过化疗或放疗。其中男72例，女63例；平均年龄61.00±1. 64岁（24～84岁）。
（2）正常对照组 收集同期武汉大学中南医院健康体检者152例，其中男92例，女60例；平均年龄50.03±1.47岁（21～77岁），均为无血缘关系的湖北汉族人，既往无消化道症状、无糖尿病、系统性红斑狼疮、关节炎及炎症性肠病等病史。
1.2 方法
（1）DNA提取：取3ml抗凝血，用蛋白酶K（Merck公司）消化，酚/氯仿法提取基因组DNA。
（2）Fas-670基因PCR扩增：Fas-670基因片段PCR引物根据文献设计，由北京三博远志生物工程技术有限公司合成，顺式5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’；反式5’-GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3’。PCR反应体系总体积25l，含灭菌双蒸水18.51，10×PCR反应缓冲液2.5l，每侧引物各10pmol， dNTPs（Clontech公司）10mmol/L 0.5l，TaqDNA聚合酶（Biostar公司）2U，DNA模板11（约40～100ng）。反应条件：94℃预变性4分钟，接着30个循环，94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，72℃终末循环5分钟，最后置于4℃终止反应。
（3）限制性内切酶消化PCR扩增产物：取10l PCR产物，用限制性内切酶Mva I（MBI公司）0.5l（10U/l）于37℃消化酶切过夜，于65°C灭活20分钟。
（4）PCR产物鉴定：对消化后的PCR产物片段采用2%琼脂糖凝胶电泳电泳（100V，1.5小时）分离，溴化乙锭染色分析基因型。
233+99G
A（233+99bp）
G（189+99+44bp）
4 结果
4.1 Fas-670点多态性酶切结果:Fas-670基因626位点电泳酶切结果见图1。基因型C/C纯合子酶切片段为189、99、44bp三条带, G/G纯合子为233和99bp二条带, C/G杂合子酶切片段为189、99、44bp和233bp四条带。
4.2 Fas-670基因型Hardy-Weinberg平衡检验:经χ2检验, 胃癌组和正常对照组人群Fas-670基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。（胃癌组χ25.630, P>0.05; 正常对照组χ23.449,P>0.05）。
4.3 胃癌患者Fas-670位点基因多态性分析:如表1所示，与正常对照组比较，胃癌患者组FAS-670位点C/G+G/G基因型频率略低（62.9% vs 67.5%；Fisher exactp0.4667; OR1.219; 95% CI0.7582-1.662）；并且，慢性胃炎组的FAS-670位点C/G+G/G基因型频率与正常对照组比较也略低（66.2% vs 67.5%；Fisher exactp0.8809;odds ratio1.058; 95% CI0.5880-1.905）；胃十二指肠溃疡组的FAS-670位点C/G+G/G基因型频率与正常对照组比较也略高（69.6% vs 67.5%；Fisher exactp0.8783; odds ratio1.058; 95% CI0.588-1.905）。
表1示，在FAS-670位点，胃癌组C、G等位基因频率与正常对照组无明显差异（p0.4262;odds ratio1.115; 95% CI0.8369-1.595）。
表1 胃癌、慢性胃炎、胃十二指肠溃疡及正常对照组FAS-670-626基因多态性分布
5 讨论
M acFarlane等报道,FAS-670基因（death receptor 4 gene , FAS-670）626等位基因与胃癌发生危险性无关,日本Frank B[1]的研究并也支持上述结果。本研究选择武汉地区正常人作为对照, 对武汉地区FAS-670基因多态性和胃癌的关系进行研究。本研究结果支持Frank B 和Mac Farlane等的研究结果,这说明携带FAS-670的626等位基因与增加武汉地区胃癌发病的危险性无关。我们对FAS-670基因多态性的研究结果与国外的研究比较发现, 武汉地区人群FAS-670的 等位基因频率与欧洲等国家相似。虽然本研究发现胃癌组和正常组之间宿主基因因素FAS-670的等位基因的分布不存在差异,但这并不能排除这些等位基因可能增加胃癌发病风险的可能。
在本次研究中没有发现武汉正常人群中FAS-670位点多态性与胃癌之间有相关性，我们分析原因有如下可能样本选取的偏倚，我们选取的为武汉市汉族人，为一个地区的一个民族，所以可能出现了假阴性结果，所以我们可以在以后进一步扩大样本含量包括不同民族进行研究；也可能是由于胃癌的发生在不同国家、地区、种族间都存在着明显差异，胃癌的发生机制可能不同。总之，胃癌是一类异质性很高、变化复杂的恶性综合征，但是胃癌细胞的主要特征是基因组不稳定性，基因组不稳定性可发生在不同水平,从单核甘酸、微卫星、基因、染色体结构性成分直至整条染色体。我们目前的研究发现FAS-670G/C基因型与武汉地区胃癌发生的风险无关，为了确定胃癌的易感基因我们还需要在不同对象中进行进一步的研究。
参考文献
[1] Levine AD, Fiocchi C. Regulation of life and death in lamina propria T cells. Semin Immunol 2001;13:195-199
[2] Suzuki A, Sugimura K, Ohtsuki K, et al.Fas/Fas ligand expression and characteristics of primed CD45RO+ T cells in the inflamed mucosa of ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol 2000; 35:1278-1283
目的 探讨老年缺血性脑卒中与内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）基因变数串联重复序列（VNTR）多态性的关系。方法 选择老年缺血性脑卒中患者112例作为病例组，同期选择年龄与性别相匹配的健康志愿者或其他住院患者105例作为对照，通过PCR技术和聚丙烯酰胺电泳来确定其基因型。结果 病例组eNOS基因ab基因型的频率明显高于对照组(22.3% vs 12.4%，P＜0.05)，a等位基因的频率也高于对照组（12.9% vs 7.0% ，P＜0.05）。结论 ab基因型与老年缺血性脑卒中有相关性，a等位基因可能是中国老年缺血性脑卒中的独立危险因素。
【关键词】 一氧化氮合酶；基因多态性；VNTR；老年；缺血性脑卒中
血管内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）编码基因存在多种基因多态性。其中，第4号内含子27个碱基的变数串联重复序列（VNTR）多态性与血浆一氧化氮（NO）水平密切相关，该多态性与心脑血管病的相关性研究较多，但结论并不一致。Matyar等〔1〕研究发现内皮细胞型NOS(eNOS)4a/b基因多态性是南部土耳其人冠心病的独立危险因素，而Vasilakou等〔2〕发现在希腊人中该基因多态性与早发的冠心病没有相关性。本研究的目的是探讨eNOS基因VNTR多态性与中国老年缺血性脑卒中的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 入选标准
选择2002年7～12月在青岛大学医学院附属医院住院的112例老年缺血性脑卒中患者作为病例组，其中36例短暂性脑缺血发作(TIA)，76例脑梗死，均行头颅MRI和/或CT扫描明确诊断，符合1996年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准，并排除脑出血和占位性病变。选取同期住院的其他疾病患者和健康志愿者105例作为对照。对照组均无脑卒中或冠心病病史。病例组平均年龄(64.9±11.2)岁，男62例；对照组平均年龄(63.9±11.9)岁，男53例，两组的年龄与性别相匹配，入选对象均行血糖、血脂等检查。
1.1.2 诊断标准
高血压的诊断标准为血压≥140/90 mmHg或正服用降压药物；糖尿病的标准为空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降血糖药物；吸烟的标准为正在吸烟>5支/d或有吸烟史，血脂异常的标准为总胆固醇(TC)≥5.62 mmol/L和/(或)甘油三酯(TG)≥1.92 mmol/L或服用降血脂药物。
1.2 方法
1.2.1 提取基因组DNA
入选者均于清晨空腹抽取静脉血1 ml，加20 μl EDTA（浓度150 ng/ml）抗凝，4℃冰箱短期存放。采用UltraPureTM基因组DNA提纯试剂盒（北京赛百盛公司生产），提取的基因组DNA置于-20℃保存。
1.2.2 目的基因片段PCR扩增方法
引物参照Uwabo等〔3〕的设计。正义寡核苷酸序列为5′GGGAACCTCAGCCCAGTAGTGAA3′，反义寡核苷酸序列为5′GTGGTCACAGGCGTTCCAGTAAC3′。反应总体系50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，引物各5 μl，模板DNA 2 μl（约150 ng），Taq酶1.5 U（0.3 μl），甲酰胺1μl，用双蒸水补齐至50 μl。反应条件：预变性94℃ 3 min后进入循环，每个循环为：变性94℃ 45 s，退火56.5℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，35个循环后72℃延伸12 min终止反应。取3 μl PCR扩增产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上做垂直电泳，电压60 V，时间3 h，以pGEM7Zf(+)HaeⅢ Marker（华美公司生产）为参照，在0.5 μg/ml溴化乙锭染液中染色40 min后在紫外线灯下观察结果并照相。
1.3 统计学分析
采用SPSS统计软件，计量资料组间比较用非配对的t检验，计数资料组间比较用χ2检验，应用Logistic回归分析计算比数比并进行危险因素独立性分析。
2 结 果
2.1 病例组与对照组各种危险因素比较
吸烟、高血压、糖尿病等在病例组的比例均较对照组高（P0.05），见表1。表1 两组各危险因素的比较〔n(略)〕
2.2 eNOS基因VNTR多态性电泳结果
eNOS基因VNTR多态性主要有2种等位基因，27 bp的序列重复4次为a，重复5次为b，在电泳图中分别为417 bp和444 bp的片段，从而构成3种基因型(aa，ab，bb)，见图1。
2.3 两组eNOS基因型和等位基因频率的比较
病例组与对照组的ab基因型频率分别为22.3%和12.4%，两者比较有显著差异(P
2.4 病例组各种危险因素的独立性分析
病例组各危险因素及eNOS VNTR多态性的比数比（OR）分析及95％可信区间（95% CI），见表3。通过对各种危险因素的多元Logistic回归分析发现，高血压、糖尿病、吸烟及ab基因型与老年缺血性脑卒中均明显相关，是老年缺血性脑卒中的独立危险因素。表3 病例组各危险因素以及ab基因型的OR值及95％CI（略）
3 讨论
NOS是NO合成的关键酶，可催化精氨酸代谢为NO和瓜氨酸。根据细胞和组织来源分为3种：神经元型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和免疫型NOS(iNOS)。eNOS主要存在于血管内皮细胞中，可以被多种介质激活，包括乙酰胆碱、P物质、组氨、精氨酸、血管加压素、缓激肽、前列腺素F和内皮素R等。eNOS的激活导致内皮细胞中NO的产生增加，并引起一系列的生物学效应，如舒张平滑肌细胞，抑制血小板聚集和黏附于血管内皮，抑制血管平滑肌细胞的增生，阻碍低密度脂蛋白的过氧化而发挥抗动脉粥样硬化作用等。NO还可通过抑制内皮素和血管紧张素的产生从而抑制血管平滑肌细胞的增生。
人类eNOS的编码基因位于第7号染色体长臂（7q36），含有26个外显子和25个内含子，总长21 kb，编码产物为含有1 203个氨基酸的蛋白质。该基因存在多个多态性位点，其中研究最多的是4号内含子的VNTR多态性、7号外显子G849T多态性和启动子区T786C多态性。VNTR多态性主要有2种等位基因，27 bp的序列重复4次为a，重复5次为b，从而构成3种基因型(aa，ab，bb)。eNOS基因多态性可影响eNOS的功能，导致血管系统中NO浓度改变，并由此影响动脉粥样硬化的发生和发展，因此可能与冠心病和缺血性脑血管疾病有关。
eNOS基因不同位置的变异与心脑血管疾病的相关性不同。1996年Wang等〔4〕发现，澳大利亚长期吸烟者的eNOS第4号内含子基因多态性与冠心病关系密切，吸烟和eNOS4a/a分别在环境和遗传方面是导致冠心病的主要因素。Lee等〔5〕对韩国男性冠状动脉疾病病人暷研究也发现eNOS基因a/b多态性与小于51岁的男性患者的冠状动脉疾病的发展有相关性。Salim等〔6〕发现冠心病患者的等位基因a的频率明显高于对照组。Hou等〔7〕对中国人的研究，证实了eNOS第4号内含子基因多态性可能是中国人缺血性脑血管疾病的独立危险因素，在无常见危险因素的缺血性脑血管病患者中尤为显著。
eNOS基因多态性与冠心病、心肌梗死的关系得到了多国学者的肯定，但也存在分歧。德国学者Sigusch等〔8〕栐1 043例欧洲人的研究表明，冠心病及其严重程度与eNOS4a/b多态性无相关性。Yahashi等〔9〕对日本人该基因多态性与缺血性卒中的关系进行了研究，127例患者（其中18例为血栓栓塞，58例为腔隙性脑梗死，51例为无症状性腔隙性脑梗死）与91例对照的b等位基因频率之比为0.862/0.868，缺血性卒中亚组中等位基因的频率之比为0.889/0.862/0.853，其差别均无统计学意义。MacLeod等〔10〕在361例缺血性卒中患者与236例对照中，对eNOS基因7号外显子的G894T多态性进行了相关研究，发现NN基因型在两组中的分布无差异，提示该多态性与动脉粥样硬化性脑梗死和TIA无关。
本研究发现老年缺血性脑卒中组ab基因型的频率较对照组明显增高（22.3% vs 12.4%），a等位基因的频率在病例组也明显偏高（12.9% vs 7.0%）。用多元Logistic回归分析校正了年龄、高血压、糖尿病和吸烟等危险因素的影响后，ab基因型较bb基因型的OR为1.98（95% CI=0.87～3.56，P< 0.05），与Hou等〔7〕报道的结果一致，更进一步证实了在中国人群中eNOS基因VNTR多态性与缺血性脑卒中有相关性，ab基因型可能是影响中国老年人发生缺血性脑卒中的独立危险因素。
参考文献
1 Matyar S，Attila G，Acarturk E，et al.eNOS gene intron 4 a/b VNTR polymorphism is a risk factor for coronary artery disease in Southern Turkey〔J〕.Clin Chim Acta，2005；354(12):1538.
2 Vasilakou M，Votteas V，Kasparian C，et al.Lack of association between endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of premature coronary artery disease in the Greek population〔J〕.Acta Cardiol，2008；63(5):60914.
3 Uwabo J，Soma M，Nakayama T，et al.Association of a variable number of tamden repeats in the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with essential hypertension in Japanese〔J〕. Am J Hypertension，1998；11（1 Pt 1）:1258.
4 Wang XL，Sim AS，Badebhop RF，et al.A smokingdependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene〔J〕.Nat Med，1996；2(1):415.
5 Lee WH，Hwang TH，Oh GT，et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean malles〔J〕.Vasc Med，2001；6(2):1038.
6 Salim S，Firoozrai M，Nourmohammadi I，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene intron4 VNTR polymorphism in patients with coronary artery disease in Iran〔J〕.Indian J Med Res，2006；124(6)：6838.
7 Hou L，Osei Hyiaaman D，Yu H，et al.Association of a 27bp repeat polymorphism in ecNOS gene with ischemic stroke in chinese patients〔J〕. Neurology，2001；56(4)：4906.
8 Sigusch HH，Surber R，Lehmann MH，et al.Lack of association between 27bp repeat polymorphism in intron 4 of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary artery disease〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2000；60(3):22935.
关键词：ADH2；ALDH2；基因多态性；饮酒；胃癌
中国分类号：R183.3*2文献标志码：B
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，而有关饮酒与胃癌的关系研究颇多，研究结论各异。部分研究认为饮酒不是独立的危险因素或危险因素很弱，而乙醇脱氢酶2(ADH2)、乙醛脱氢酶(ALDI-L2)基因多态性与胃癌易感性也存分歧。ADH2和ALDH2是酒精代谢的两种酶，前者将乙醇氧化成乙醛，而后者将乙醛氧化成醋酸。ADH2和ALDH2的编码基因有高度的多态性，ADH2可分为G／G(变异型纯合子)、G／A(杂合子基因型)和A／A(野生型纯合子)3种基因型，ALDH2也可分为G／G(野生型纯合子)、G／A(杂合子基因型)和A／A(变异型纯合子)3种基因型。为探索ADH2、ALDH2基因多态性及饮酒与胃癌的联系，为此类研究提供有关数据，结合有关专题开展本研究。
1 资料与方法
1.1 资料来源
病例来自常熟市2005年8月-2006年8月期间经市二级医院确诊，具有本地区常住户口男性原发胃癌新发病例，病例均经手术或病理确认。常熟市疾病预防控制中心登记201例，其中161例新发病例是通过原发灶病理诊断。对照组采用随机抽样的原则，抽取同性别、上下年龄不超过2岁、与病例居住在同村、或同一乡镇有常熟市常住户口的非肿瘤居民，病例组平均年龄为64.65岁，对照组199例，平均年龄为64.61岁。
1.2 方法
采用统一的调查表由经专门培训的调查员通过访谈的方式调查每位研究对象，并由质控人员对每张调查表进行审查和验收，对可疑项目重新调查。调查项目包括调查对象的一般情况、饮酒情况等内容。对全部研究对象抽静脉血，置乙二胺四乙酸钠抗凝管，分离白细胞层。用Q IAamp DNA提取试剂盒提取白细胞DNA，DNA置－30℃低温冰箱保存备用。饮酒定义为：相当于每周饮高度白酒至少1次，连续半年以上。酒精消耗总量，按照含酒精饮料中纯酒精量计算，以“千克・年”为单位(平均每天饮纯酒精的千克数×饮酒年数)。含酒精饮料的酒精浓度参照《中国食物成分表2004》计算。
1.3 基因型分析
采用多聚酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)检测ADH2 Arg47His和ALDH2 Glu487Lys基因型。ADH2Arg47His扩增所用引物为F：5‘-GGG CTrTAG ACTGAA’FAA CCTTGG-3‘和R：5‘-AGG GAAAGA GGA AAC TCC TGA A-3‘。ALDH2 Glu487Lys扩增所用引物为F：5’TGCTATGATGTGTITGGAGCC和R：5’－GGC TCC GAG CCA CCA-3‘。杂合子基因型可从DHPLC图形直接确定，野生型纯合子和变异型纯合子的DHPLC图形相同，需与已知纯合型混合，经过变性和复性过程，再次上样DHPLC仪分析确定。检测基因扩增产物购自宝生生物工程有限公司，PCR产物上样鉴定仪器为WAVE-3500(Transgenomic，USA)。
1.4统 计学分析
数据录入用Epidata 3.0软件，用SAS 8.0软件进行统计分析，以比值比(OR)及95％可信限(95％)表示相对危险度。
2 结果
2.1 两组均衡性检验
对病例组和对照组文化程度以及职业等一般情况进行均衡性检验，结果见表1，两组相关因素无统计学差异(P>0.05)。
2.2 ADH2和ALDI-12基因不同分型与胃癌的关系
分别以ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)，ADH2基因非野生型和ALDH2基因非野生型的组合与之比较分析，结果见表2。无论是ADH2基因型还是ALDH2基因型，杂合子基因型和变异型纯合子并未增加胃癌的危险性，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.3 ADH2和ALDI-12基因不同分型组合与胃癌的关系
以病例和对照ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2基因野生型(G／G)为参照，ADH2基因非野生型和AL-DH2基因非野生型的组合与之比较分析，结果见表3。ADH2基因杂合子基因型、变异型纯合子和ALDH2基因杂合子基因型、变异型纯合子的不同组合，并不增加胃癌的危险性，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.4 饮酒与胃癌的相关性
对是否饮酒以和胃癌的相关性进行分析研究，结果见表4，进行趋势性检验，结果差异均无统计学意义(P>0.05)，未发现胃癌与饮酒有相关性。
2.5 ADH2、ALDH2基因不同基因组合及饮酒与胃癌的关系
根据代谢活性高低以饮酒者的ADH2基因和ALDH2基因型的任意组合和不饮酒者代谢酶活性高的ADH2野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)组合进行比较，比较时以酒精消耗量1.5千克・年进行分层，其结果见表5。任何其它组合即使酒精消耗量高于1.5千克・年，都未能增加胃癌的危险性，差异均无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
胃癌的危险因素比较复杂，而有关饮酒和胃癌之间的争议一直很大。张栓虎有关饮酒与胃癌发病关系的Meta分析中，27个研究中有4个OR值无显著性意义。鲍萍萍等研究发现，上海地区男性居民饮酒和胃癌的病例对照研究中，没有发现饮酒和胃癌有相关性，而女性重度饮酒者与胃癌有关。认为是不同性别对酒精的反应不同。
【关键词】 食管鳞状细胞癌；类胰岛素生长因子1；微卫星多态性
Abstract Objective: To investigate the relationship between a microsatellite polymorphism (CA repeats) in the insulin-like growth factor I gene and the risk of esophageal squamous cell carcinoma. Methods: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism was genotyped among 78 cases with esophageal squamous cell carcinoma and 470 normal controls by fluorescent labeled fragment analysis. And data were analyzed using unconditional logistic regression to evaluate the association of examined polymorphism with esophageal squamous cell carcinoma. Results: No association was found between IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism and esophageal squamous cell carcinoma. Conclusion: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism (CA repeats) does not play a major role in the development of esophageal squamous cell carcinoma.
Key words Esophageal squamous cell carcinoma; Insulin-like growth factor I (IGF-Ⅰ); Microsatillite polymorphism
类胰岛素生长因子1（IGF-Ⅰ）是一种多功能肽，能够促进细胞的增殖、分化和抑制细胞的凋亡[1]。有研究显示IGF-Ⅰ在癌症的发生过程中起到了重要作用[1]，而其基因的启动子区域有一个高度多态性的微卫星标记，即CA重复与血循环中的IGF-Ⅰ水平相关联[2]。有一些研究已经检测了这一多态性与乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的关系，但结果不太一致[3-6]。到目前为止未见有这一多态性与食管癌关系的报道，因此在本研究中，我们检测了两者之间是否关联。
1 材料与方法
1.1 样本 我们收集了78例食管鳞状细胞癌患者为观察组，470例为正常对照组。观察组所有病例均经病理学确诊，年龄范围48～79岁，平均年龄64岁，其中男性57例，女性21例。正常对照组年龄范围48～80岁，平均年龄62岁，其中男性388例，女性82例。
1.2 基因分型 我们用酚/氯仿抽提法提取DNA，然后采用荧光标记片段分析法进行基因分型。15μL PCR反应体系中含有25ng基因组DNA，200μM dNTPs，0.3μM引物（F:5'-FAM-GCTAGCCAGCTGGTGTTATT-3';R:5'-ACCACTCTGGGAGAAGGGTA-3'），2.5mM MgCl2，0.6U DNA聚合酶。PCR的反应条件为：95℃预变性12分钟，然后10圈循环，每一循环中94℃预变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；然后再20圈循环，每一循环中89℃预变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；最后72℃再延伸5分钟。扩增后，1μL PCR产物和9μL Hi-DiTM甲酰胺以及0.5μL GeneScanTM-500LIZTM标准大小片段混合，在ABI 3730分析仪上进行毛细管电泳，并用GeneMapper 4.0生物软件分析样品基因型。
1.3 统计分析 我们用Monte-Carlo法检测基因型分布在正常对照中是否符合Hardy-Weinberg平衡；非条件性Logistic回归分析来估计相对发病风险，并以优势比（ORs）和95%可信区间（95% CIs）表示。所有的OR值都平衡了性别、年龄、吸烟和饮酒等因素的影响。在本研究中，IGF-Ⅰ基因型分为3组：（1）最常见等位基因192bp纯合子；（2）192bp杂合子；（3）其它。
2 结果
在本研究中，IGF-Ⅰ基因微卫星多态性CA重复显示有9个等位基因，长度从184bp到200bp，最常见等位基因为192bp，等位基因分布在观察组和对照组中差异没有统计学意义，见表1。在正常对照组中，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，这一多态性与食管鳞状细胞癌的发病没有关联，见表2。表1 IGF-Ⅰ (CA)n等位基因在样本中的分布表2 IGF-Ⅰ (CA)n 基因型与食管鳞状细胞癌的关联
3 讨论
食管癌是一种高度致死性癌症，其5年生存率仅为10%，目前改善其低生存率只能通过早期肿瘤筛查获得 [7]，因此识别一些高度易感人群对疾病的防治是非常重要的。
大量证据显示IGF-Ⅰ系统在食管癌的发病过程中作用显著。一些研究提示在人类食管癌中IGF-Ⅰ可通过自分泌作用刺激肿瘤细胞的生长[8-9]；而一些群组研究（cohort study）也显示血清中IGF-Ⅰ水平升高与食管癌的发病风险呈显著关联[10-11]。由于血循环中IGF-Ⅰ的浓度并不总是能直接反映局部组织中的产生量，因此识别一些基因多态性可能会帮助我们鉴别IGF-Ⅰ在局部和全身中的长期暴露水平。
双生子研究显示不同个体IGF-Ⅰ水平不同，大约有40%～60%是由遗传因素决定的[12]。在本研究中我们所检测的微卫星多态性CA重复位于启动子区域，在转录起始位点上游约1 kb处，而且含有特异的调控元件[13]。因此，这一多态性等位基因的改变可能导致IGF-Ⅰ基因转录的改变；或者这一多态性与其它位于启动子区域或其附近的多态性处于连锁不平衡，从而影响IGF-Ⅰ mRNA的稳定性或IGF-Ⅰ的半衰期[14]。虽然有研究显示这一多态性与血循环中的IGF-Ⅰ水平相关联[2]，然而我们的研究并不支持它与食管鳞状细胞癌的发病相关联。但是，我们的样本量只有约80%的效能检测到最低OR值为2，因此，我们并不能排除这一多态性对疾病的OR值低于2的效应，关于IGF-Ⅰ微卫星标记CA重复与食管鳞状细胞癌关系的最终结论还需要许多其它大的研究来确证。
参考文献
[1] Ibrahim YH，Yee D.Insulin-like growth factor-I and cancer risk[J].Growth Horm IGF Res，2004，14(4):261-269.
[2] Vaessen N，Heutink P，Janssen JA，et al.A polymorphism in the gene for IGF-Ⅰ:functional properties and risk for type 2 diabetes and myocardial infarction[J].Diabetes，2001，50:637-642.
[3] Cleveland RJ，Gammon MD，Edmiston SN，et al.IGF1 CA repeat polymorphisms，lifestyle factors and breast cancer risk in the Long Island Breast Cancer Study Project[J].Carcinogenesis，2006，27(4):758-765.
[4] Slattery ML，Samowitz W， Curtin K，et al.Associations among IRS1， IRS2， IGF1，and IGFBP3 genetic polymorphisms and colorectal cancer [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13(7):1206-1214.
[5] Tsuchiya N，Wang L， Suzuki H，et al.Impact of IGF-Ⅰ and CYP19 gene polymorphisms on the survival of patients with metastatic prostate cancer[J].J Clin Oncol，2006， 24(13):1982-1989.
[6] Wen W， Gao YT， Shu XO，et al.Insulin-like growth factor-I gene polymorphism and breast cancer risk in Chinese women[J].Int J Cancer，2005， 113(2):307-311.
[7] Lagergren J.Adenocarcinoma of oesophagus:what exactly is the size of the problem and who is at risk[J].Gut，2005，54 （Suppl 1）:i1-5.
[8] Liu YC，Leu CM，Wong FH，et al.Autocrine stimulation by insulin-like growth factor I is involved in the growth， tumorigenicity and chemoresistance of human esophageal carcinoma cells[J].J Biomed Sci，2002，9(6 Pt 2):665-674.
[9] Chen SC， Chou CK，Wong FH，et al.Overexpression of epidermal growth factor and insulin-like growth factor-I receptors and autocrine stimulation in human esophageal carcinoma cells[J].Cancer Res，1991，51(7):1898-1903.
[10] Sohda M，Kato H，Miyazaki T，et al.The role of insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor binding protein 3 in human esophageal cancer[J].Anticancer Res，2004，24(5A):3029-3034.
[11] Yilmaz O，Eroglu A，Dag E，et al.Serum levels of IGF-Ⅰ and IGFBP-III and their relation with carcinoembryonic antigen and carbohydrate antigen 19-9 in cases of esophageal cancer[J].Int J Clin Pract，2006， 60(12):1604-1608.
[12] Harrela M，Koistinen H，Kaprio J，et al.Genetic and environmental components of interinpidual variation in circulating levels of IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ，IGFBP-1，and IGFBP-3[J].J Clin Invest，1996，98(11):2612-2615.
[关键词] 肿瘤坏死因子；基因多态性；易感基因
[中图分类号]R73[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）05（c）-004-03
肿瘤坏死因子（TNF）是体内具有多种生物活性的细胞因子，根据其来源不同可分为两种：TNF-α和TNF-β。它们主要是由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子，可以诱生TNF自身和IL-1、IL－6等其他细胞因子，增加HLA－I、HLA－II类抗原表达，促进B、T细胞增殖和免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能。编码TNF-α和TNF-β的基因分别称为TNF-α基因和TNF-β基因，与MHC基因紧密连锁，TNF-α基因和TNF-β基因位于HLA-DR以及HLA-B位点之间的HLA-III抗原基因簇，即6p21.3[1]。
1 TNF基因多态性
TNF－α基因由4个外显子和3个内含子及5'端非翻译区及3'端非翻译区组成，近来研究表明，TNF－α有16个多态性位点，包括5个微卫星、10个复等位基因和一个1C插入位点，其多态性位点已证实的有：－308、－238、＋70和－376位点的GA碱基变化，－863位点CA、－1031位点TC、－857及－850位点CT的碱基变化，其中4个多态性位点在TNF－α基因启动子区域[2]。Wilson等[3]首先报道了TNF－α基因启动子区域内转录起始点上游第308位点的双等位基因多态性，308位点为鸟嘌呤核苷酸G时，定义为TNF1，308位为腺嘌呤核苷酸A时定义为TNF2，TNF1较常见，TNF2较罕见。这一位点的突变造成了限制性内切酶（Nco I）识别位点的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被Nco I识别并切断，即限制性片断长度多态性（RFLP）。另有研究表明，TNF2因能通过增强转录产生更多的TNF－α，故也将其称为TNF－α高产型。Wilson等的研究表明，该多态性位点在白色人种与HLA－DR3 连锁不平衡相关；且－308A等位基因与HLA－DR3、A1、B8单倍型显著相关[4]。但也有学者认为TNF－α基因多态性是独立于HLA之外的一类疾病风险因子，因而其表达产物TNF－α与HLA基因型无关。TNF－β基因多态性位点在第一内含子、转录起始位点下游第252位点（＋252位点）的鸟嘌呤核苷酸G被腺嘌呤核苷酸A替代，这一位点的突变使Nco I识别序列发生了变化，致使被A所替代的核苷酸序列不能被Nco I识别并切断。TNF－β基因多态性还包括：5'非翻译区的一个多态性残基、3'非翻译区的一个EcoR I限制性片断长度多态性、在外显子3'处有一个替换及多个TNF微卫星等位基因[2]。
2TNF基因多态性与有关易感性恶性肿瘤
2.1 消化道恶性肿瘤
TNF－α在肝坏死性炎症、纤维形成、肝细胞癌变的过程中起着重要作用。Suneetha等[5]研究表明，HBV感染后肝损伤严重的患者和肝损伤轻微的患者中，TNF－β等位基因的分布频率有显著区别。严重肝损害患者TNF－β A/A等位基因出现频率要明显高于对照组。而TNF－α－308位点的基因多态性似乎与肝损伤的严重程度不相关。Kim等[6]的研究表明，TNF-α-308A（TNF-α-308 A/G或A/A）或－863位A缺失（TNF-α-863 C/C）变异体与HBV感染的消除有关。TNF-α单倍体1（－1 030T；－863C；－857C；－308G；-238G；－163G）和单倍体2（－1 030C；－863A；－857C；－308G；-238G；－163G）与HBV的清除、保护性抗体的产生相关。目前还未见有文献报道TNF基因的多态性与肝癌的易感性有关，但肝炎后引起的肝损害是肝癌发病的高危因素。Lee等[7]的研究表明， TNF-α－308位点的基因多态性的分布频率在胃癌组与正常对照组中无显著性差异，且和胃癌的组织学类型无相关性。Perri等[8]研究表明，在意大利的两个胃癌的高发地区和低发地区，TNF－α－308位的多态性和基因频率与胃癌无相关性，并且在HP阳性组和阴性组中，TNF－α－308基因的分布频率没有明显的差别。但另有研究表明，TNF－α－308A等位基因与HP感染相关。Ohyama等[9]的研究表明，TNF－α－857基因(C/C,C/T,T/T)的分布频率在胃癌组和正常对照组中无显著差别，TNF－α－857 T/T和HP感染与增生性胃炎相关，TNF－α－857T等位基因可能促进胃癌扩散。Lee等[10]分析了韩国人口中5种TNF－α启动子多态性(-1 031,-863,-857,-308和-238)及2种TNF－β多态性（内含子1和苏氨酸26天门冬酰氨）在胃癌组、十二指肠溃疡组和正常对照组间的不同，发现单独的多态性与胃癌和十二指肠溃疡的发病风险不相关。对7种多态性进行单倍体分析，单倍体型在对照组、胃癌组和/或十二指肠溃疡组间区别不明显，但个体单倍体C和D（在－1031，－863和－857位点上有相反的等位基因）的频率在胃癌组和十二指肠溃疡组间有显著差别，这提示TNF/LTA基因型在胃癌和十二指肠溃疡的发病机制上起完全不同的作用。
2.2 呼吸系统肿瘤
Selfart等[11]研究了117名肺癌患者（包括77名非小细胞肺癌患者和40名小细胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多态性，发现非小细胞肺癌组TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多态性与对照组相比有显著性差异，而小细胞肺癌组与对照组相比则无显著性差异。
2.3血液系统肿瘤
Mainoufowler等[12]报道的54例来自北欧的非霍奇金淋巴瘤LT－α＋252位多态性检测结果表明该位点的等位基因频率与对照组无显著性差异。近来，Chouchane等[13]对124例来自突尼西亚的恶性肿瘤患者进行了研究（其中NHL 44例、乳腺癌40例、其他肿瘤40例），发现恶性肿瘤患者TNF2等位基因频率较正常对照组明显升高，而TNF1基因型则明显降低，提示该纯合型可能是一个抑癌的保护型；相反，携TNF1/2杂合型患者患NHL的危险性增高，这一结果似乎表明TNF的多态性与NHL发生的易感性有关。但Bilkay等[14]却得出了不同的结果，他们调查了273例来自法国的NHL患者，发现TNF－308位合LTα＋252位等位基因频率与对照组相同，提示其多态性与淋巴瘤的发生无关。Demeter等[15]检测了73例CCL的德国患者TNF－308位和LTα＋252位等位基因，发现CLL患者TNF1等位基因频率明显升高，但与疾病进展无关，而LTα＋252位等位基因频率患者组与对照组无显著性差异，但在进展期CLL患者中的该等位基因频率增加，再发生自身免疫性溶血性贫血的CLL患者中，大部分人携有LTα＋252位等位基因。这些研究表明，低水平的TNF－α/LTα与CLL的发生发展有关，与细胞因子自分泌、旁分泌有关的免疫基因在CLL的病情进展中起作用。
2.4 泌尿系统肿瘤
Bilkay等[15]分析了肾细胞癌患者中TNF－α－308 G/A的基因多态现象和等位基因分布频率，结果提示TNF－α－308 G/G基因型可能是保护性因素，但基因多态现象和等位基因分布频率与对照组相比无明显差别。Nakajima等[16]分析了81例来自日本的肾细胞癌患者TNF－α－238、－308、488位点的三个基因多态现象，结果发现在－238和488位点GA的突变和GA基因型在晚期肾细胞癌患者中较常见，－238和488位点的基因多态现象与肾细胞癌病程发展相关。Bong等[17]分析了73例前列腺癌患者TNF－α基因启动子-308位点及488位点基因多态性现象,发现-308位点GA基因型及488位点GA基因型在前列腺癌患者中较为多见,因此推测TNF－α基因-308位点及488位点基因多态性与前列腺癌易感性相关。March等[18]研究了膀胱癌患者中TNF－α 488及-859两个位点的多态性，发现TNF－α 488A和TNF－α-859T与膀胱癌发生密切相关,并且这些基因的多态性与肿瘤分期有关。
2.5其他恶性肿瘤
Smith等[19]研究了144例女性乳腺癌患者TNF－α-308位点的基因多态现象,发现-308位点的GG基因型比其他基因型个体更易患乳腺癌。Sarvestani等[20]研究了233名来自伊朗的女性乳腺癌患者TNF－α-308位点及TNF-β 252位点的基因多态现象,认为这两个位点的基因多态现象与乳腺癌的易感性无相关性。Duarte等[21]研究了195名进展期宫颈癌患者TNF－α-308位点的基因多态现象,发现-308AA基因型在宫颈癌患者中较为常见,然而这并没有统计学意义,这可能和AA基因型在人群中较为罕见有关。Deshpande等[22]研究了宫颈癌患者TNF的11个多态性位点，发现-572、-857、-863位点的基因多态现象与宫颈癌的易感性相关。Skov等[23]研究了TNF－α-308位点的基因多态现象与基底细胞癌的易感性之间的关系,发现基底细胞癌的发生与TNF－α的高水平表达相关,但未发现其易感性与此位点的基因多态现象有关。Pandey等[24]研究了TNF－α基因多态现象与肉瘤的易感性的关系,发现TNF－α-308位点及-238位点的基因多态现象与肉瘤的易感性之间无明显关系。
3 结语
综上所述,TNF基因的多态性与某些恶性肿瘤的发生、发展和预后有关,由于TNF基因的多态性造成TNF转录水平的变化，进而影响TNF的表达,而TNF直接或间接参与肿瘤的发生、发展,因此TNF基因多态性可作为某些肿瘤易感性的遗传标志,随着对TNF基因多态性与肿瘤的易感性等研究的不断深入,必将从基因水平对某些肿瘤的病因、病理生理等方面的认识产生一个新的飞跃。
[参考文献]
[1]Mocellin S,Rossi CR,Pilati P,et al.Tumor necrosis factor, cancer and anticancer therapy[J].Cytokine Growth Factor,2005,16（1）:35-53.
[2]Frigerio S,Ciusani E,Pozzi A,et al, Tumor necrosis factor microsatellite polymorphisms in Italian glioblastoma patients[J].Cancer Genet Cytogenet,1999,109(2):172-174.
[3]Wilson AG.An allelic polymorphism within the human tumor necrosis factor alpha promoter region is strongly associated with HLA A1 B8 and DR3 alleles[J].J Exp Med,1993,177:557-560.
[4]Wilson AG,Symous JA,Mcdowell TL,et al.Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor-α promotor on transcriptional activation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(7):3195-3199.
[5]Suneetha PV,Sarin SK,Goyal A,et al.Association between vitamin D receptor,CCR5,TNF-α and TNF-β gene polymorphisms and HBV infection and severity of liver disease[J].Journal of Hepatology,2006,44(5):856-863.
[6]Kim YJ,Lee HS,Yoon JH,et al.Association of TNF-α promoter polymorphisms with the clearance of hepatitis B virus infection[J].Human Molecular Genetics,2003,12(19):2541-2546.
[7]Lee YJ,Kim HY,Kim KH,et al.Association of polymorphism of IL-10 and TNF-A genes with gastric cancer in Korea[J].Cancer Letters,2005,225(2):207-241.
[8]Perri F,Piepoli A,Bonvicini C,et al.Cytokine gene polymorphisms in gastric cancer patients from two Italian areas at high and lower cancer prevalence[J].Cytokine,2005,30(5):293-302.
[9]Ohyama I,Ohmiya N,Niwa Y,et al.The association between tumour necrosis factor-α gene polymorphism and the susceptibility to rugal hyperplastic gastritis and gastric cancinoma[J].European Journal of Gastroenterology and Hepatology,2004,16(7):693-700.
[10]Lee SG,Kim B,Yook JH,et al.TNF/LTA polymorphisms and risk for gastric cancer/duodenal ulcer in the Korean population[J].Cytokine,2004,28(2):75-82.
[11]Selfart C,Selfart U,Plagens A,et al.Analysis of TNF-α,TNF-β,IL-6 and HSP-70 polymorphisms in patients with lung cancer[J].Resp Med,2005,78(1):152-160.
[12]Mainoufowler T,Dickinson Am,Taylor PRA,et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms in lymphoproliferative disease[J].Leuke Lympho,2000,38(5-6):547-552.
[13]Chouchane L,Ahmed SB,Baccouche S,et al.Polymorphisms in the tumor necrosis factor-α promoter region and in the heart shock protein 70 genes associated with m alignant tumors[J].Cancer,1997,80(8):1489-1496.
[14]Basturk B.Cytokine gene polymorphisms as potential risk and protective factors in renal cell carcinoma[J]. Cytokine,2005,30(1):41-45.
[15]Demeter J,Porzsolt F,Ramisch S,et al. Polymorphism of tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin-alpha genes in chronic lymphocytic leukaemia[J].Br J Hawmatol,1997,97(1):107-114.
[16]Nakajima K,Sasaki M.Tumor necrosis factor-α gene mutations and genotype changes in renal cell carcinoma[J]. The Journal of Urology,2001,165:612-615.
[17]Bong R.OH.Frequent genotype changes at -308, and 488 regions of the tumor necrosis factor-α gene in patients with prostate cancer[J].The Journal of Urololgy,2000,163:1584-1587.
[18]Marsh HP. Polymorphisms in tumor necrosis factor are associated with risk of bladder cancer an grade of tumor at presentation[J].British Journal of Cancer,2003,89:1096-1101.
[19]Smith K.C.Cytokine gene polymorphisms and breast cancer susceptibility and prognosis[J]. European Journal of Immunogenetics,2004,31:167-173.
[20]Sarvestani EK. Polymorphism in the genes of alpha and beta tumor necrosis factors and gamma interferon among Iranian women with breast cancer[J]. Cancer Letters,2006,223:113-119.
[21]Duarte I. G-308A TNF-α polymorphism is associated with an increased risk of invasive cervical cancer[J]. BBRC,2005,334:588-592.
[22]Deshpande A.TNF-α promoter polymorphisms and susceptibility to human papillomavirus 16-associated cervical cancer[J].JID,2005,191(15):969-976.
[23]Skov L.Basal cell carcinoma is associated with high TNF-α release but not with TNF-α polymorphism at position-308[J]. Experimental Dermatology,2003,12:772-776.
[24]Pandey JP. TNF-α,IL1-B, and immunoglobulin gene polymorphisms in sarcoidosis[J]. Human Immunology,2002,63:485-491.
【关键词】Graves病；细胞间粘附因子1；基因多态
The associative study of Intercellular adhesion molecule 1’s gene polymorphism in Graves disease
LI Ying，XU Ai-mei.Qingdao Central Hospital,Shandong Qingdao 266042,China
【Abstract】 Objective To investigate the association between Intercellular adhesion molecule1(ICAM-1)with the polymorphism of it’s the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)and the Graves disease of Chinese Hans in northern China.Methods The serum ICAM-1 concentration and the allele of its the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and the PCR sequence-specific primers method(PCR-SSP)in 202 Chinese Hans in northern China,including 139 patients of Graves Disease(GD).According to the age when GD occured,the GD cases were divided into two groups,the early-onset group including 78 cases(
【Key words】Graves disease;Intercellular adhesion molecule 1;Genepolymorphism
Graves病(graves dieases，GD)目前被认为是一种器官特异性自身免疫病[1-2],有显著的遗传倾向，目前发现它与HLA类型有关[1]。ICAM-1是一条分子量约80~100ku的糖蛋白，具有5个跨膜结构，是LFA-1分子的天然配体之一，其基因定位在19号染色体上[3-4]。GD最显著的病理组织学特点是甲状腺、眼睛等效应器官内淋巴细胞的浸润，血液循环中的淋巴细胞向效应部位的迁徙首先是通过其与血管内皮细胞的相互作用来启动，二者相互作用的前提是内皮细胞的活化，ICAM-1可以加强内皮细胞的活化过程[5]。
1 材料与方法
1．1 研究对象及分组
1．1．1 研究对象 202名无血缘关系的山东地区汉族人，均为青岛市中心医院内分泌科住院或门诊患者及体检健康成人，其中初诊未治疗GD患者139名，均具有典型的高代谢症群，不同程度弥漫性甲状腺肿伴或不伴甲状腺外损害(眼征，胫前黏液性水肿)，实验室检查血FT3>5．6 pmol/L，FT4>25．5 pmol/L，sTSH
1．1．2 分组 GD组 139例，男/女=26/103，年龄16~67岁，平均(45．24±7．26)岁。根据发病年龄分为两个亚组：①早发GD(EGD)组：发病
正常对照(CON)组共63例，男/女=13/50，年龄18~68岁，平均(46．97±6．74)岁。
设计、实施、评估者：上述实验设计为第一作者实施，各项生化指标测定均由接受过专业培训的固定实验人员完成。
1．2 实验方法
1．2．1 受试者均于隔夜空腹抽静脉血5 ml，室温静置30 min，3 000转离心15 min，分离血清；应用电化学发光仪(德国罗氏公司生产Elecsys2010型)立即测定FT3、FT4、TSH、、TGAB、TPOAB。所有标本统一编号保存，其余各项指标均统一标准，一批完成测定。
1．2．2 取ACD抗凝全血300 ul，用Promega公司的全血DNA抽提试剂盒，提取基因组DNA。①应用PCR-SSP方法，扩增包含ICAM-1基因第4外显子721GA位点与第6外显子1405AG位点的基因片段，同时扩增腺瘤样息肉基因第15外显子的一段256 bp片段作为内对照链；上游序列：两条721位点和一条对照链上游引物：1：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACG-3'(代表721位点为G)；2：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACA-3'(代表721位点 A)；3：5'-ATGATGTTGACCTTTCCAGGG-3';下游序列：两条1405位点和一条对照链下游引物：4：5'-GCACATTCACGGTCACCTC-3'(代表1405位点为G)5：5'-GCACATTCACGGTCACCTT-3'(代表1405位点为A)6：5'-TTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC-3';②反应体系置于PCR扩增仪，96℃预变性2 min，96℃变性30 s循环6次，69℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环35次后于72℃终延伸5 min;③2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物：取PCR扩增产物6 μl，按5：1(V/V)与6×上样缓冲液混合后，上样与2%琼脂糖凝胶(含0．5 μg/ml EB)，0．5×TBE中80V电压电泳30 min，与紫外透射仪下观察结果。用DNA Marker 作对照，可观测到两种长度为269 bp和967 bp的扩增片段;④电泳结果的分析：由于引物序列的特异性，对于上游序列，只在含有上游引物1的反应体系中显示有967 bp扩增片段的表明721位点为GG基因型，只在含有上游引物2的反应体系中显示有967 bp扩增片段的表明721位点为AA基因型，而在含有上游引物1、2的反应体系中均显示有967 bp扩增片段的表明721位点为GA基因型；同样分析下游位点，显示1405位点有GG、GA、AA三种基因型。对于具体患者，共有GGGG、GGGA、GGAA、GAGG、GAGA、GAAA、AAGA(前两个字母代表721位点，后两个字母代表1405位点)七种基因型。
2 结果
2．1 各组一般临床资料 正常对照(CON)组与甲亢(GD)组的年龄、性别构成比均无显著性差异(P>0．05)、FT3、FT4、TSH、TRAB、TGAB、TPOAB均有显著性差异(P0．05)。(见表1)。
2．2 ICAM-1基因第4外显子721GA多态与GD的相关性
2．2．1 ICAM-1基因第4外显子721GA多态检测结果 在PCR扩增结果中显示引物1、4组或1、5组反应体系得到片段的，证明第4外显子721位为G等位基因；而引物2、4组或2、5组反应体系得到片段的，第4外显子721位为A等位基因。根据等位基因判断具体患者的基因型有三种情况，分别为GG、GA、AA。(见表2)。
2．2．2 ICAM-1基因第4外显子721GA多态位点不同基因型和等位基因与GD的相关性 GD组的三种基因型频率与CON组无明显差别(P>0．05)，G等位基因频率和A等位基因频率与CON组无明显差异(P>0．05)；但EGD组GA+AA基因型频率显著高于LGD组和CON组(P
2．3 ICAM-1基因第6外显子1405AG多态与GD的相关性
2．3．1 ICAM-1基因第6外显子1405AG多态检测结果 在PCR扩增结果中显示引物1、4组或2、4组反应体系得到片段的，证明第6外显子1405位为G等位基因；而引物1、5组或2、5组反应体系得到片段的，第6外显子1405位为A等位基因。根据等位基因判断具体患者的基因型有三种情况，分别为GG、GA、AA。(见表4)。
2．3．2 ICAM-1基因第6外显子1405AG多态位点不同等位基因与GD的相关性 GD组的三种基因型频率与CON组无明显差别(P>0．05)，GD组的A等位基因频率和G等位基因频率与CON组无明显差异(P>0．05)； EGD组GA基因型频率与LGD组无明显差异(P>0．05)，EGD组与LGD组的A等位基因频率和G等位基因频率也无明显差别(P>0．05)。(见表5)。
2．4 统计学方法 计量资料用（x±s）表示，各组均数之间的比较用方差分析。运用Hardy-Weinberg检验样本的群体代表性。用基因计数法计算各组等位基因频率，各组间等位基因频率的比较用卡方检验，P
3 讨论
GD的发病与遗传密切相关，有明确的临床资料显示HLA-Ⅱ等位基因(DR3和DQA10501)和CTLA-4基因多态性与GD发病有关[2，6-7]。另外，基因组研究发现GD的其他遗传异感基因位点在染色体14Q31，18Q21，20Q11以及XQ21[8-9]。
现在所得出的结论是基于早期关于ICAM-1基因多态性的研究。前期研究发现ICAM-1基因多态性与多种人类自身免疫性疾病有关。外显子4C721G-A使氨基酸链第241位由甘氨酸变为精氨酸,外显子6C1405A-G使第469位由赖氨酸变为谷氨酸。现已证实：ICAM-1结合点区(外显子4)与第五抗原相似区(外显子6)的基因多态性可以改变ICAM-1的特性：细胞黏附与共同趋化能力[10]。推测这种ICAM-1功能区的氨基酸替代可以改变ICAM-1结构和功能从而影响GD的临床表现。可以提高巨噬细胞功能．其他免疫递呈细胞相关的细胞因子(HLA及CTLA-40)的基因多态性可以影响GD的易感性和发病年龄[2，6]。
现已所知ICAM-1的基因多态性可以调节某些自身免疫疾病的免疫状态[11-12]。例如：1型糖尿病、多发性大动脉炎以及克隆氏病[13-15]。等位基因A(R241)的高表达,C721GA(G241R)以相应的自身抗体在溃疡性结肠炎患者中发现[16]。另外,与研究结果相一致的是，Nishmura等发现ICAM-1基因的第6外显子基因多态性与1型糖尿病的发病年龄有关[13]。移植后肾衰的患者ICAM-1基因第C.721位等位基因A是肾移植后长期存活者的两倍，受者ICAM-1E469的变异与急性的肾移植后肾衰有关[11]。
简而言之，研究结果显示ICAM-1基因多态性可能影响甲亢的发病年龄。其原因可能是由于ICAM-1基因多态性造成氨基酸替代而影响自身免疫反应的强度和持续性，是ICAM-1抗原类似区与受体结合后的结果。在动物模型中已经显示：通过腺病毒基因技术短暂性地阻断LFA-1/ICAM-1通路可以防止自身免疫的发生而不引起经典的免疫抑制[17]。笔者推测这种技术可以调整ICAM-1的结构，从而推迟GD发病年龄，延长缓解期，以及对GD的临床表现有一些影响。
参考文献
［1］ Weetman A.Grave’s disease.N Engl J Med,2000,343：1236-1248.
［2］ Allahabadia,Heward JM,Nithiyananthan R et al.MHC class II region,CTLA4 and ophthalmopathy in patients with Graves disease.Lancet，2001，358：984-985.
［3］ Arao T,morimoto I,Kikanuma,et al.Thyrocyte proliferation by cellular adhesion to infiltrating lymphocytes through the intercellular adhesion molecule-1/lymphocyte function-associated antigen-1 pathway in Graves' disease.J Clin Endocrinol Metab，2000，85(1)：382-389.
［4］ Bertry-Coussot L,Lucas B,Danel C,et al.Long-term reversal of established autoimmunity upon transient blockade of LFA-1/intercellular adhesion molecule-1 pathway.J Immmunol，2002，168：3641-3648.
［5］ Arreaza G,Yoshikawa N,Mukuta T,et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 on human thyroid cells from patients with autoimmune thyroid disease：study of thyroid xenografts in nude and severe combined immunodeficient mice and treatment with FK-506.J Clin Endocrinol Metab,1995,80：3724-3731.
［6］ Heward JM,Allahabadia A,Armitage M,et al.The development of Graves’ disease and the CTLA-4 gene on chromosome 2q33.J Clin Endocrinol Metab,1999,84：2398-2401.
［7］ Maciel LMZ,Rodrigues SS,Dibbern RS,et al.Association of the HLA-DRb1*0301 and HLA-DQA1*0501 alleles with Graves’ disease in a population representing the gene contribution from several ethnic backgrounds.Thyroid,2001,11：31-35.
［8］ Tomer Y,Barbesino G,Greenberg DA,et al.Mapping the major susceptibility loci for familial Graves’ and Hashimoto diseases：evidence for genetic heterogeneity and gene interactions.J Clin Endocrinol Metab,1999,84：4656-4664.
［9］ Davies TF.Autoimmune thyroid disease genes come in many styles and colors.J Clin Endocrinol Metab,1998,83：3391-3393.
［10］ Diamond M,Staunton D,Marlin S,et al.Binding of the integrin Mac-1(CD11b/CD18)to the third immunoglobulin-like domain of ICAM-1(CD54)and its regulation by glycosylation.Cell,1991,65：961-971.
［11］ MacLaren AJ,Marshall SE,Haldar NA,et al.Adhesion molecule polymorphisms in chronic renal allograft failure.Kidney Int,1999,55：1977-1982.
［12］ Borozdenkova S,Smith J,Marshall S,et al.Identification of ICAM-1 polymorphism that is associated with protection from transplant associated vasculopathy after cardiac transplantation.Hum Immunol,2001,62：247-255.
［13］ Nishimura M,Obayashi H,Maruya E,et al.Association between type 1 diabetes age-at-onset and intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)gene polymorphism.Hum Immunol,2000,61：507-510.
［14］ Killestein J,Schrijver HM,Crusius JBA,et al.Intercellular adhesion molecule-1 polymorphisms and genetic susceptibility to multiple sclerosis：additional data and meta-analysis.Ann Neurol,2000,47：277-278.
［15］ Braun C,Zahn R,Martin K,et al.Polymorphisms of the ICAM-1 gene are associated with inflammatory bowel disease,regardless the p-ANCA status.Clin Immunol,2001,101：357-360.
【关键词】 进展性卒中 VEGF936C/T 单核苷酸多态性
Correlative study on 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and advancing stroke
［Abstract］ Objective To investigate the association between 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and stroke in progression risk.Methods Using the method of restrictive fragment length polymorphism（RFLP），the VEGF genotypes of 66 stroke in progression patients，134 completed stroke patients and 100 healthy control subjects were detected.The association between VEGF 936C/T gene polymorphism and stroke in progression was compared.Results The frequency of VEGF carreiers with 936T-allele（936CT+936TT）in progression stroke patients was significantly higher than that in control group，while the frequency of VEGF 936T allele in completed stroke was similar with that in control group.There was positive association between VEGF 936T and stroke in progression（OR 1.882;95% CI 1.269～2.789）.Conclusion VEGF 936T-allele can raise the risk of stoke evolution while VEGF 936CC can decrease the risk of stroke in progression.
［Key words］ advancing stroke;VEGF 936C/T;single nucleotide polymorphisms
进展性卒中（stroke in progression，SIP）是指卒中发病后神经功能缺失症状在48 h内逐渐进展或呈阶梯式加重。其发病率为卒中患者的30%，致残率和致死率较一般卒中高，是影响病人预后的重要原因之一，也是脑血管病治疗中的难点。目前，已经发现的危险因素有高血压病、糖尿病、感染、人疱疹病毒感染和脑血管狭窄等。尽管我们对以上危险因素进行了积极的防治，仍有一部分患者会进展。说明进展性卒中的病因仍没有完全阐明。遗传、多基因、多态性这三个方面是进展性卒中研究的热点。应用单核苷酸多态性进行遗传性相关性研究，可以为脑卒中进展的危险性提供预示作用。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）因其可以增加血管通透性，诱导血管新生，促进缺血部位侧支循环的建立，使其成为目前缺血性疾病研究的热点之一。脑血管内皮细胞的凋亡和缺血半暗带细胞的坏死是进展性卒中的发病机制。然而，发生在VEGF基因3’端非转录区936位点的常见突变，即C-T易位，其中，VEGF936T据报道与VEGF的低血浆水平显著相关［1］。国内外有研究证实，VEGF936T与乳腺癌［2］、糖尿病肾病等的发生密切相关。基于上述，我们推测VEGF936C/T多态性与进展性卒中相关。现探讨VEGF 936T与进展性卒中的相关性如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2005年1月～2006年1月期间哈尔滨医科大学附属二院神经内科病房的住院患者200例，男107例，女93例，年龄35～75岁，平均（62±10.3）岁，排除其他肿瘤性疾病。按病变进展情况分为普通脑梗死组134例和进展性卒中组66例。对所有患者标明有无进展性卒中可能的危险因素［3］（糖尿病、高血压病、感染、脑血管狭窄＞50%、高血脂、高尿酸、高纤维蛋白原），同时选取与病例组的性别和年龄相匹配的健康志愿者100例作为对照组。所有研究对象均为东北汉族人。
1.2 仪器与试剂 人血基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）由TIANGEN-QIAGEN提供；Taq酶、dNTP、10×loading buffer、20bp DNA marker购自Takara公司；NIaⅢ限制性内切酶购自NEB；VEGF引物合成由美国ABI公司完成。
1.3 方法 用RFLP法鉴定VEGF的基因型。抽取每位受检者空腹静脉血3ml，按照常规方法从白细胞中提取基因组DNA，4 ℃保存。PCR引物参照文献［2］设计并合成，正向引物：5’-AAGGAAGA GGAGACTCTGCGC-3’，反向引物：5’-TATGTGGGTGGGTGTGTCTA CAG-3’。PCR反应体系50 μl，包括正向反向引物各1 μl、dNTP4 μl、模板DNA 8 μl、Taq酶1 μl、ddH2O 30 μl、lodding buffer 5 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性4min、95 ℃变性30s、60 ℃退火45s、72 ℃延伸45s、30个循环后、72 ℃再延伸5min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，为198bp。PCR产物用限制性内切酶NIaⅢ（New England Biolabs）5 u于37 ℃消化3 h后，再经4%琼脂糖凝胶电泳鉴定VEGF基因型。
1.4 统计学方法 所有数据应用windows SPSS 13.0统计软件进行分析。Hardy-Weinberg平衡和计数资料用 χ2检验；通过Logistic回归筛选进展性卒中的危险因素，优势比（odds ratio，OR）用来衡量卒中进展的风险性。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
用RFLP法鉴定VEGF的基因型，其电泳结果见图1。VEGF 936C不被分解（198bp），而VEGF936T被分解为两段（分别为114bp和84bp）。糖尿病、高血压病、感染、脑血管狭窄和VEGF936T携带者均是进展性卒中的危险因素。病例组和对照组的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，进展性卒中组与普通脑梗死组基因型分布情况比较见表1；进展性卒中组与健康对照组基因型分布情况比较见表2；普通脑梗死组与健康对照组基因型分布情况比较见表3。说明进展性卒中组和普通脑梗死组的VEGF936 C/T基因型分布不同，不能认为普通脑梗死组和健康对照组的VEGF936C/T基因型分布相同。进展性卒中组VEGF936T等位基因携带者的频率为50%，显著高于普通脑梗死组的31.3%，进展性卒中的936T等位基因携带者的比值比OR值为1.882，95%的可信区间为1.269～2.789，见表4。说明VEGF936T等位基因携带者与VEGF936CC纯合子的患者相比卒中进展的风险性会增高1.882倍。表1 进展性卒中组和普通脑梗死组VEGF936基因型分布的比较 表2 进展性卒中组和健康对照组VEGF936基因型分布的比较表3 普通脑梗死组和健康对照组VEGF936 基因型分布的比较表4 进展性卒中VEGF936T有关参数的估计值
3 讨论
通过对VEGF 3’端非转录区936位点基因多态性在进展性卒中组、普通脑梗死组和健康对照组中的比较，我们发现，936C/T突变减少了VEGF的表达，VEGF936T与进展性卒中相关。该结果显示，VEGF基因多态性，至少在东北汉族人中，是进展性卒中的主要遗传危险因子；然而，我们不能排除VEGF基因的其他一些至今未知的突变，以及另外一些基因的突变在进展性卒中的易感性危险因素中起一定作用。
VEGF可以增加血管通透性，诱导血管新生，同时，VEGF作为局部内生性调节剂，能够保持内皮细胞的完整性，维持内皮细胞的正常功能，从而避免触发内源性或外源性凝血途径［4］。研究发现VEGF还能够增加丝氨酸蛋白酶、纤维蛋白溶解酶、尿激酶和组织型纤溶酶原的表达和活性，从而发挥抗血栓形成作用［5］。目前国外有文献报道，VEGF对缺血脑细胞DNA损害与修复具有重要影响［6］，另有文献报道，VEGF可诱导抗凋亡蛋白的表达，是内皮细胞的一个生存因素。如果VEGF的量低于阈值，脑血管内皮细胞将因为VEGF依赖的内皮细胞生存过程的缩短而程序性死亡［7］。因此VEGF可以通过阻止血栓进展、溶解已形成的血栓，建立侧支循环、减缓细胞凋亡等方面来防止卒中的进展。
脑梗死时，缺氧可导致进行性的毛细血管内皮细胞和上皮细胞的丢失以及细胞外基质和神经元的坏死，这些细胞的坏死是通过凋亡发生的。在脑卒中的发生发展中，多种潜在的遗传危险因素可能参与其发病机制。在进展性卒中中，可能有VEGF的表达不足和经VEGF受体2的信号传达的缺陷，源于内皮细胞受体数量的下降，或者VEGF受体/蛋白激酶活性的缺陷。影响VEGF分泌的因素有很多，VEGF936T据报道与血管内皮生长因子的低血浆水平显著相关。缺氧可诱导内皮细胞的凋亡，加速半暗带细胞的不可逆的坏死，而缺氧诱导的VEGF的表达的增高可延缓内皮细胞的凋亡，促进侧支循环的形成，促进脑梗死的恢复，当缺氧对脑组织的损害作用与其诱导的VEGF高表达对脑组织的保护作用失衡时，将会导致进展性卒中的形成。由此我们推测，VEGF936T携带者由于VEGF分泌的相对不足而导致了卒中的进展。
VEGF936T等位基因者血浆低VEGF水平的确切机制至今未知。对潜在的转录因子结合位点的分析表明：VEGF936C有一个潜在的AP-4［1］（activator protein 4）结合位点，而936T则没有，936位C-T突变导致了AP-4的潜在结合位点丢失。AP-4是一个螺旋环-螺旋转录因子。它通过结合于特殊的增强位点增强多种基因的转录。AP-4的潜在结合位点被VEGF936C-T突变破坏也许可以解释该突变同VEGF的低血浆水平的相关性。另一个可能的解释是该突变同VEGF基因序列其他部位未知突变之间的连锁性失衡。
影响VEGF分泌的因素有很多，将来各种刺激因素所诱发的VEGF的表达，与特殊基因型之间的相互关系将引发对VEGF介导的进展性卒中的个体易感性的鉴别。对疾病相关性的研究也许会揭示发生在VEGF基因序列其他位置的未知的功能性突变同进展性卒中患者之间的关联性。
【参考文献】
1 Renner W，Koschan S，Hoffman C，et al.A common 936C/T mutation in the gene of vascular endothelial growth factor is associated with vascular endothelial growth factor plasma levels.J Vasc Res，2000，37:443-448.
2 Krippl P，Langsenlehner U，Renner W，et al.A common 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor is associated with decreaced breast cancer risk.Int J Cancer，2003，106:468-471.
3 贺维亚，黄晓哲，蒋建华.进展性卒中相关危险因素的临床分析.中风与神经疾病杂志，2004，21（5）:461-462.
4 Couffin T，Kearney M，Witzenbichler B，et al.Vascular endothelial growth factor /vascular permeability factor in normal and atherosclerotic human arteries.Am Pathol，1997，150（5）:1673-1685.
5 Pepper MS，Ferrara N，Oci L，et al.Vascular endothelial growth factor induces plasmminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun，1991，181（2）:902-906.
