发布时间：2024-03-06 14:44:43
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的发育生物学的研究进展样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
【关键词】性别控制，畜牧业，性别决定，发展前景
性别控制一直是生命科学的重要研究课题之一，性别控制技术是指通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门现代生物技术，是一项能显著提高家畜繁殖效率的生物工程技术，对家畜育种，生产和遗传疾病的繁殖都有很重要的意义。在畜牧业生产中许多性状受到性别因素的制约，性别控制技术对于我国现有生产条件不变而奶制品和肉制品需求迅速增加的现状来说，更意味着生产资料的高效利用和畜牧业生产效率的提高。
1性别决定原理
哺乳动物性别分化之前，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。胚胎是含有牟勒氏管、吴夫氏管两套生殖导管和未分化性腺的中性胚，性腺原基分化的类型决定了机体将来性别的发育（张红卫等，2001）。当性腺原基被决定因子（SRY）诱导发育成，支持细胞则会分泌抗牟勒氏管因子而使牟勒氏管解体，这时吴夫氏管发育为雄性生殖管道。当性腺原基发育为卵巢，由卵巢分泌的雌激素则使牟勒氏管发育为阴道、子宫和输卵管等（朱必才等，2002）。目前发现， 性别决定过程中有三种基因调控未分化性腺的发育及雄性性别决定，分别是WT-1、SF-1和SOX9。
2性别控制方法
目前研究性别控制的途径和方法主要集中在受精前X、Y的分离，受精后的胚胎性别鉴定和控制。
2.1 X与Y的分离
精母细胞经过有丝分裂后产生X、Y两种不同类型的，如果X和卵子结合则产生雌性后代，若Y和卵子结合则产生雄性后代。分离动物中X和Y， 是解决家畜性别控制的关键问题。
X和Y的差异主要表现在：形态上，X 头部比较大， DNA含量多；在重量和比重上，X重，比重大且表面膜电荷多；在运动性和活力方面，Y活动能力较强， 速度快；耐酸碱性方面，Y 嗜碱不耐酸；并且YF一小体阳性（朱晓华等，2001）。
目前分离X和Y的方法主要有：沉积分离法、梯度离心法、电泳法、白蛋白沉淀法、免疫法、流式细胞仪分类法。
沉积分离法主要是利用X沉积速率比Y快的原理来分离，但是这种方法由于缺乏重复性和其它动物实验的证实而为广泛采用（张光勤和李建民，2002）。梯度离心法是根据X染色体的体积比Y染色体的大，且比重不同等特点来分离的，但是该方法只能做到大部分分离，因此性别控制也只能达到70～80%（岩崎说雄等，1987；张光勤和李建民，2002）。电泳法主要是根据X、Y所带的生物电不同而设计的一种分离方法，以中型缓冲液电泳时向阳离子移动的X比Y多来对进行分离，但是分离结果的准确性和重复性都不理想，并且在电泳液中不易存活，分选后的活力低，因此难以推广（张淑娟，2005；George et al.， 2002）。
白蛋白沉淀法是依据Y在白蛋白溶液中的运动速度比X的快的原理来分离的，但是这种方法对于性别比例的改变并不是十分明显，因此存在争议（White et al.， 1984；石磊和岳文斌，2007）。免疫法是根据H-Y抗原特异表达于Y细胞膜上，利用H-Y抗体来检测抗原，但是有研究表明X也能结合抗H-Y抗原抗体，因此，在本质上X、Y会共享抗原（Zavos，1983；Hendriksen，1999）。
目前比较理想的方法是流式细胞仪分类法，它是根据X、YDNA含量的微小差异来分离的，是当前分离纯度最高的一种方法，一般分离率可达70～90%，而且分离后的仍具有发育能力，其主要缺点是分离速度慢、时间较长、成本高难以商业化（冯伯森等，2000；George et al.， 2002； 张明和卢克焕，2003；陆阳清等，2005）。
2.2胚胎性别鉴定
胚胎性别鉴定的主要方法有核型分析法，X-相关酶法，免疫学方法，分子生物学方法等。核型分析法通过查明胚胎细胞的性染色体类型为XX型和XY型来鉴定胚胎的性别，该方法准确率高，几乎可达到100%，但操作繁琐，对胚胎有一定的伤害，不适合生产实际，目前主要用来验证其它性别鉴定方法的准确率（葛宝生等，1998；华进联等，1999）。X-相关酶法是通过测定与X染色体相关的酶活性来鉴定雌性胚胎的一种方法，其依据是：在胚胎发育早期，雌性的一条X染色体失活；在胚胎基因组的激活和X一染色体失活之间的短暂时期内，雌性的两条X一染色体都可以被转录和翻译，这表明在雌性胚胎中与X一染色体相连的酶细胞内活性是雄性的两倍，但这种方法中测定次黄漂吟磷酸核糖转移酶对致密桑套胚或囊胚阶段的胚胎应用有困难，难以确定X染色体失活的准确时间，并且还具有潜在的细胞毒性（魏雅萍，2003；张传生和杜立新，2001；冯伯森等，2000）。
免疫学方法是利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而鉴定胚胎性别的一种方法，它包括间接免疫荧光法和细胞毒性分析法（Hossepian，1993）。间接免疫荧光法先将胚胎在H-Y抗血清或单克隆抗体中培养，再用异硫氰酸盐荧光标记的免疫球蛋白IgM处理， 然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧光素， 若有则判定为H一Y+胚胎， 不显荧光则为H一Y-胚胎。这种方法虽然不损害胚胎，准确率高，但是具有一定的主观性（冯伯森等，2000）。细胞毒性分析的原理是在补体存在的情况下，H一Y抗体可以和H-Y阳性雄性胚胎结合并使卵裂球溶解，而仍能正常发育的为雌性胚胎。但是这种方法对细胞杀伤作用，已很少采用（冯伯森等，2000；张光勤和李建民，2002）。分子生物学方法是近十几年发展起来的一种利用雄性特异性SRY基因和PCR扩增技术鉴定性别的一种方法。扩增后经电泳检测，能扩增出序列的为雄性，反之为雌性。这种方法灵敏度高， 准确率高，是目前为止最为理想的胚胎性别鉴定方法之一（魏雅萍，2003）。
3性别控制的意义
性别控制具有重大的意义，其一，可以大大提高畜牧业的经济效益。畜牧业生产中不同性别的家畜有不同的用途，因此可运用此技术提高大量雌性个，如奶牛、母鸡的数量，而且可以节约雄性个体在繁殖年度的饲料消耗。相，雄性肉牛，绵羊和猪等增重要快，肉质优良等特点也可通过此技术控制多产雄比后代。并且可以有效的防止牛的异性孪生不育症。其二，可以排除动物群体中的有害基因，预测和控制家畜的遗传和表型性别，增加选育强度，获得最大的遗传进展。其三，控制性别与胚胎移植，胚胎冷冻等技术的应用，可加速濒危动物，珍稀动物的繁殖和保种进程。.性别控制也是体外受精，核移植单精注射及转基因动物的一项配套技术，它的应用必将促进其它生物技术的发展。
我国是个发展中国家，奶、肉人均消费长期曾低于世界平均水平，近年来经济飞速发展，我国对奶、肉的需求量巨增，通过性别控制技术来快速繁殖性别控制后代，能更好地满足社会快速的需求增长（文国艺，2004）。
4问题及其发展前景
性别主要是由遗传决定的，目前家畜的性别控制技术已在商业上应用，并且已成为畜牧业发展中的主要技术之一。尽管应用流式细胞仪分离已取得了很大进展，但是性别控制技术在生产中的普及还存在许多限制性的因素，如成本高，耗时长，技术要求高等。我们可以通过添加饲料营养或碱性饲料、添加微量元素、按摩、提高冷冻的解冻温度等措施来提高产雌率（齐义信和李爱芸，2001；赵峰，2002；白海湖，1997；姜忠玲，2004）。
畜牧业的发展促进了家畜性别控制的研究，目前动物的性别控制技术已取得了一定成果，但距离对生物性别进行有效控制或使用胚胎性别鉴定达到实用化水平还有一定差距。运用流式细胞分离法和SRY基因PCR扩增法是准确而发展前景比较广阔的性别控制方法，但是分离速度较慢，因此，需要提高速度以便在生产中广泛应用，同时加强与体外受精和显微受精技术的结合，从而提高的利用率。运用SRY基因PCR技术鉴定胚胎性别关键在于提高灵敏度减少细胞取样对胚胎的损伤，取样胚胎冷冻后移植妊娠率等。另外， 需要研究家畜SRY基因PCR扩增试剂盒，使这种方法的操作简单而实用，同时广泛的进行研究运用胚胎工程等学科的前沿技术来提高性别控制的准确率，将在畜牧业上得到广泛的应用。可以相信，随着研究的深入和相关生物技术的发展，效果耿介稳定的性别控制技术是可以实现的，并且哺乳动物的性别控制技术与胚胎移植技术、体外受精技术、胚胎冷冻技术相结合将会共同推动畜牧业产业化的前进。
参考文献：
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【关键词】进化生物学 课程 教学改革
【中图分类号】G642.0 【文献标识码】A 【文章编号】1674-4810（2014）14-0025-02
进化生物学是在生物进化论的基础上发展起来的一门学科。20世纪后期，随着遗传学、生物化学，尤其是分子生物学的发展，推动生物进化论从推理到验证，从定性到定量，使得这门学科由模糊的理论推测日渐发展为脉络清晰的系统学科。它从各门功能生物学科获得研究基础，综合形成的一般规律和理论又成为整个生命科学的发展线索。迈尔曾说：“进化生物学是生命科学中的最大的统一理论”，是建立在生命科学各层次研究和各分支学科基础之上的理论综合。由于进化生物学涉及学科广泛，是高度概括的综合性理论，实践环节存在困难等原因，导致进化生物学教学有其独特性，本文从教学实践经验出发，就进化生物学课程改革方面进行探索。
一 课程目标的设置
针对进化生物学既是生命学科各分支学科的综合，也是生命科学领域的一门前沿学科，又是生命科学的一个核心理论的课程特点，在课程目标的设置上力求做到以下三点：
1.牢固掌握本课程基础知识和理论
主要包括生命及其在地球上的起源、细胞的起源与进化、生物发展历程、微观进化、宏观进化、遗传系统的进化及人类起源等问题，这些知识既是进化生物学教学的主要内容，也是学生学习的重点所在。这些内容涵盖了各门生物学分支学科的成就，特别是把植物学、动物学、细胞学、遗传学、生态学和分子生物学等结合起来研究有关生命进化的问题，力求让学生在掌握生命进化的基本历程、进化的动力机制，学会对进化现象进行正确的理论分析的基础上，培养对生命科学各分支学科融会贯通的能力。
2.密切结合生命科学研究中各学科的最新研究进展
进化生物学是生命科学中一个相当活跃的领域，新知识、新理论层出不穷。本课程以现代达尔文综合进化论为基础，同时密切结合生命科学研究中的最新进展，把各个学科前沿进展融入教学过程中，如以鸟类手指同源问题讲解物种特化式进化中的分歧进化，在“适应”的问题上联系燕子为躲避车辆进化出更短的翅膀等，把一些最新进展融入理论教学中，不仅增强学生对理论知识的理解与学习兴趣，更能开拓学生的知识层面，也体现了进化生物学是一门前沿学科的地位，吸引学生从事进化生物学的研究。
3.着重培养学生对自然界进化过程的正确认识和理解
进化生物学是在哲学思想指引下产生的，研究进化的过程本身就是将古论今，“现在就是过去的钥匙”，通过学习能够加深对生态环境系统的正确理解，单独的思想教育往往说服力不足，课程中引入大量的数据和事实，培养学生对问题的分析能力，如让学生从微观进化角度对生物多样性进行分析，探讨生物大灭绝对生物环境保护的意义，从人类进化历程角度谈如何摒弃“为人独尊”的思想等，把这种思想的教育贯穿始终，帮助学生树立科学的世界观，这也是对辩证唯物主义自然观最好的验证。
二 优化课程内容体系
进化生物学研究内容贯穿生命科学的各个分支学科，甚至其他自然科学和社会科学门类中都会触及生命起源及进化的问题。在国外很多大学都把进化生物学列为生物学专业基础课、研究生基础课，甚至成为一门通识课。耶鲁大学开放课程进化、生态和行为原理从2009年录制以来风靡全球。
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* 基金项目：大庆师范学院教育教学改革项目（编号：JY1320）
在我国，很多高师院校把进化生物学课程设置为生物科学专业必修课，一般在学习最后阶段开设；也作为生物学其他专业，如生物技术、生物工程的选修课，也有院校将生命起源与进化之谜作为一门通识课来开设。由于进化生物学融汇众多交叉学科，每个学校学科课程设置各有不同，教材内容不可能完全适应具体情况，不同学校不同专业的课程内容不能一味照搬。我院曾把进化生物学作为生物科学专业必修课，生物技术专业选修课和全校学生的通识课开设，在围绕基础知识和原理的基础上，对课程内容进行了如下优化：
1.对于生物科学专业师范生而言，进化生物学课程在初中、高中课本都有体现，应该详尽系统地开设
通过对生物进化的历史过程、原因、机制、速率、趋向和物种的形成与绝灭、系统发生以及适应的起源机制等内容的学习，使学生掌握生物进化理论中的基本概念，认识生命进化的基本历程、进化的动力机制，学会对进化现象进行正确的理论分析，融会贯通各分支学科；同时激发学生对生命科学的学习兴趣，树立科学的世界观，培养具有用进化理论来综合生物学各个学科知识的能力的高素质人才。
2.对于生物技术专业的学生而言，应该有针对性地进行开设
由于生物技术专业的学生有一定的生物学基础，进化生物学课程主要应从生命史、小进化（种内水平的进化）、大进化（种以上水平的进化）及人类的起源与演化四个主要方面讲解，着重从个体、群体以及物种等不同分类群探讨进化的规律，涉及学生已掌握的细胞生物学、分子生物学和发育生物学等学科领域，加深对各个学科知识的贯通，着重对学生进行生物进化思想的培养，让学生对生物进化的本质有一个科学的认识，培养适应新时期社会高速发展的科技人才。
3.作为一门通识课，针对生物基础知识相对薄弱的学生开设，课程学时一般为18学时
课程从宏观角度对生物的发展历程、人类的起源与进化等问题入手展开，介绍地球的形成与演化、环境系统的演变、生命的起源、生物与环境的协同关系等，展示人类探索生命起源、探索天外生命的科学成果和艰辛历程。审视30亿年来主要生物类群的延续发展，探索起源、分化和灭绝等问题，使学生树立生物与环境相互联系、生物具有适应性和多样性的观点，在教学过程中加强辩证唯物主义的世界观教育，使学生正确地认识人类在自然界中的地位，人与自然协调发展的必要性，培养大学生探索科学的兴趣，增强其珍惜生命和保护环境的意识。
三 课堂教学改革
进化生物学课堂教学既要符合课堂教学的一般教学规律，又要充分体现课程的独特性。在教学过程设计上将学术性与趣味性有机结合，紧密联系生活实际，并采用灵活多变的教法，丰富的多媒体资源，让学生展开讨论和辩论等形式激发学生学习兴趣，进一步提高课堂教学质量。
1.课堂教学形式的改革，以学生活动为主体，师生角色互换
进化生物学是一门前沿的学科，有很多未知的内容等待我们去探索，对于一些前沿的问题，如恐龙灭绝之谜，地球之外是否有生命，下一次物种大灭绝的预测等问题，让学生自行组织，用多媒体报告的形式做介绍，各小组相互提问，并按照评价表进行打分，小组成绩就是小组成员的成绩，以此培养团队精神，让学生真正融入其中，真正落实“以学生为主体”的教育理念。
2.灵活运用现代教学手段，提高教学质量和效率
对现代教学手段的大规模应用还存在褒贬不一的看法，但对于进化生物学课程而言，选择有代表性的图片、音像资料能吸引学生注意力，丰富课堂内容。如古生物的化石，冥古代地球表面特征等，学生理解起来有一定的难度，但用一张想象图却能集中学生注意力，降低学习难度。另外，借鉴并剪辑国内外大型探索片、纪录片、科幻片中相关内容及其中涉及的电影片段，如《宇宙的诞生》《与远古人同行》等，这些音像资料有效地提高和调动了学生的学习兴趣，也为进一步探讨一些科学问题提供了证据和平台。多媒体课件具有信息丰富、形象、通俗易懂等特点，学生易于接受，便于他们掌握重点内容。
3.教学过程与观察、实验相结合，注重实践教学环节
作为一门理论学科，必须要有实践环节的支持，而生物进化的历程有数十亿年之久，无法真实再现当时的情境，这成了进化生物学实践环节的难题。课堂教学主要从基础课程植物学、动物学实践教学展开，通过对以往知识的回顾、实践结果的描述和多媒体图片视频展示，让学生对生物进化历程有一个初步的认识。对于有些历史阶段没有化石等直接证据，则利用解剖学、胚胎学和发育生物学等知识内容，从现存的状况去推断过去的事件，如利用系统生物学方法通过对现生类群的研究，推断生物的系统发育。还可以带领学生参观博物馆、地质馆，通过研究已灭绝的生物骨骼化石标本和对不同地质断层进行分析比较的活动，让学生获取最直观的认识，总的来看，效果还不错。
四 展望
进化生物学从探索生命起源出发，融会众多学科内容，以哲学思想概括总结出理论知识，通过认识生命来源和历程，从而加深理解生命和尊重生命，以进化的思想升华生态环境保护的意识，树立人类发展必须自觉地顺从并维护生物与环境的协同演化的观点，对于培养大学生系统地认识自然界具有重要意义。建议除了在生物相关专业开设必修课和选修课外，还应该在医学院校、师范院校和综合性院校广泛开设公共通识课，特别是在将来从事科普工作、小学幼儿教育、心理学等相关行业工作的学生中开设通识课，以此培养学生树立人与环境和谐可持续发展的观念，建立正确的世界观、人生观、价值观。
参考文献
【关键词】干细胞；肿瘤干细胞；神经干细胞
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下它可以分化成多种功能细胞。干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。目前科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞，并以这样的干细胞为“种子”，培育出一些人的组织器官。干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。本文将对肿瘤干细胞、心肌干细胞以及神经干细胞的研究做如下综述。
1、肿瘤干细胞概述
1.1肿瘤干细胞学说的提出。1960年以来，许多动物实验证明只有当肿瘤细胞数大于100万时才可以形成新的肿瘤。一些研究显示并不是所有的肿瘤细胞都能增殖，可能只有小部分肿瘤细胞具有滞留源性，而大部分是肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞。随着对干细胞研究的不断深入，发现干细胞和肿瘤干细胞之间具有许多共同特征：他们都具有多向分化潜能和自我更新能力，以及相似的细胞表面标志和相同的信号调节通路等[1]。于是提出肿瘤起源于肿瘤干细胞，是一种干细胞疾病，肿瘤是正常干细胞累计突变的结果，“肿瘤干细胞学说”应运而生。
1.2肿瘤干细胞的分离和鉴定。近年来，干细胞研究的发展很大程度上依赖于细胞分化抗原的研究进展，细胞表面特异性标志的确定是肿瘤干细胞分离的第一步。一般原则为结合谱系标志，正常干细胞特异标志（如BTSC的CD133与分离LSC的CD34）以及正常组织特异性标志等综合评价[2]，很多学者认为结合阳性标志和阴性标志可以更有效地分离干细胞。目前高通量的细胞分选系统主要有：磁性细胞分选系统和流式细胞技术（FACS）[3]。
1.3肿瘤干细胞研究方向。①研究论证是否每一种肿瘤细胞，不论是良恶性都存在肿瘤干细胞。②确定细胞表面标志，争取使用特异性强的药物杀灭肿瘤干细胞。③对已分离鉴定的肿瘤干细胞，从其特性入手，即诱导其分化，使其丧失自我更新的能力。④研究表明，Notch、wnt、Shh、Bmil等细胞信号转到通路调节正常干细胞的自我更新、增生、分化，在肿瘤的发生发展中也起着重要作用。通过研究这些细胞信号通路，有助于我们发现肿瘤细胞干细胞的靶位用于抗癌治疗。⑤发展高效的体外培养系统、细胞扩增技术以及维持干细胞未分化状态技术是今后研究的重任。目前实体瘤中的乳腺癌干细胞和淋巴造血系统恶性肿瘤干细胞已被发现并分离，但随后需进一步证实更多实体瘤肿瘤干细胞的存在，并从肿瘤中分离纯化肿瘤干细胞，在此基础上确定肿瘤干细胞的基因图谱，寻找肿瘤干细胞表现出来的特异靶位，研制新的针对于肿瘤干细胞的药物，以达到肿瘤的根治疗效。
2、心肌干细胞概述
2.1心肌干细胞简介。2003年，Beltrami等首次从大鼠心肌内分离出一种具有自我更新能力的细胞，并具有分化成心肌细胞，内皮细胞以及平滑肌细胞的能力。将这些细胞移植到心肌梗死大鼠心肌内，可分化成新的心肌细胞并明显改善心脏功能。这类细胞认为是心肌干细胞。Laflamme等的实验也证实成人心脏中有心肌干细胞的存在，它能够再生心肌，并且损伤时这种修复功能会增加[4]。Laugwitz等则证实心脏间质中存在着能完全分化成心肌表型的祖细胞。这些不同研究结果均表明了人类的成年心肌内都存在具有多向分化潜能的心肌干细胞。
2.2心肌干细胞分化起源。胚胎干细胞时全能干细胞能分化几乎全部组织和器官。1981年，鼠的胚胎干细胞首次分离成功。1998年Thomson首次从人囊胚中分离出人类胚胎干细胞。研究发现人类胚胎干细胞可以体外分化为心肌细胞。骨髓间充质干细胞也可以分化成心肌干细胞，研究发现骨髓源性祖细胞能够想造血细胞，血管和心肌等直接分化[5]。
2.3心肌细胞的定向分化及其调控。心肌干细胞向心肌分化受到多种因素的诱导和调控，目前已知细胞因子，激素，药物以及细胞内转录因子等都可以参与心急干细胞的分化调控。例如催产素可以与心肌干细胞表面受体结合，促进干细胞的有丝分裂；骨形态发生蛋白是一类在胚胎发育过程中起重要作用的蛋白家庭，它们可以参与调节某些心脏转录因子的表达，对心肌干细胞的定向分化起重要作用。
3、神经干细胞概述
3.1神经干细胞来源。①来源于脑组织，包括胚胎脑组织和成人脑组织；②来源于精髓。在胚胎和成人的脊髓室管内都存在神经肝细胞；③来源于骨髓。骨髓中存在骨髓基质肝细胞，在特定的条件下可以跨系统分化为神经元和神经胶质细胞；④脐血。人脐血是胎儿出生时期胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的肝细胞；⑤其他来源。近年来有学者发现，脐带华儿通胶来源的基质细胞有与骨髓间充质细胞相似的特性[6]。
3.2神经干细胞的分化。目前绝大多数的研究者认为，神经干细胞的分化存在细胞自身基因调控和外源性信号调控两种基质。这两种调控方式不断相互作用，共同完成对肝细胞分化的控制。现在神经干细胞分化研究还没有形成一个完全可靠的系统，仅仅只是就某一个途径或细胞因子等的研究。这主要是由于体内有上百种类型的神经元，每一种神经元的分化过程均涉及多种影响因素和信号传递。诱导神经干细胞高效分化成目的神经元或特定类型的神经胶质细胞仍处于探索阶段。
3.3神经干细胞研究前景。神经干细胞在中枢神经系统存在被证明，以及分离培养的成功是神经科学研究的一个重要突破。目前神经干细胞的研究公正如火如荼地进行，对神经干细胞的基础研究取得显著成果，但是将其常规应用于临床仍有许多问题需要解决，以及如何从动物的应用顺利的过度到临床的应用还需要进行深入的研究。
4、结语与展望
干细胞是动物机体内的一种发育全能性细胞。目前对干细胞的研究取得的进展都是在阐明干细胞的生物学特性，以及对干细胞的选择性分化和生长，然而如何对干细胞的生物学特性进行很好的控制还没弄清楚，这需要人们进一步研究和探索。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。
【参考文献】
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【关键词】儿童早期综合发展；婴儿；智能发育
【中图分类号】R 179 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0642―02
1 对象和方法
1.1 对象 选择本院门诊1个月到4个月婴儿217例，随机分为实验组113例和对照组104例，跟踪至12个月。其中实验组男64名、女49名，对照组男58名、女46名。两组母亲妊娠期无重大疾病，婴儿为出生体重≥2500g的正常新生儿，排除核黄疸、惊厥及与发育相关遗传疾病的新生儿。两组出生体重和出生情况、家庭环境等差异无统计学意义。
1.2方法
1.2.1分组方法：采用纵向对照研究的方法，分为实验组和对照组。
1.2.2实验组的实施内容
1.2.2.1实验组由儿保医师对其家长进行儿童早期综合发展指导：包括儿童系统保健管理、智能发育指导、抚触、被动操、亲子活动、疾病预防措施及亲子教育宣教等。对照组婴儿进行常规的儿童系统保健管理。两组婴儿均于出生后4至12个月期间接受体重、身长、头围测量及智能测试。
1.2.2.2 根据营养状况评价结果、体格发育评价、神经精神发育评估结果及年龄特点进行综合性早期潜能开发指导。以鲍秀兰教授《挖掘儿童潜能始于零岁》为蓝本、参照福建省妇幼保健院修订的“婴幼儿智能开发与发育简明表”指导家长对新生儿进行视、听刺激训练。1个月后到早教和干预门诊建立系统档案，由早教医师为每个孩子进行一对一指导，根据每个孩子的个性特点及不同年龄段的生长发育特点，通过做体操和用玩具、器材对婴儿进行感知觉、语言、手功能、大运动及社交能力等方面提供具有个性化的指导意见及适宜的计划给家长，教会儿童家长实施家庭训练。
1.2.2.3 每月举办一次科学育儿讲座，给家长介绍适龄益智玩具、书刊、画报，普及宣传常见病的预防知识，接受早期教育的重要性、婴儿智能发育规律及如何开发婴儿潜能的知识培训，并发给家长健康教育处方。
1.2.2.4 开办亲子园，邀请家长参加每周一次亲子活动。亲子园主要开展形式多样、丰富多彩的趣味游戏，培养婴儿的观察力、创造力、记忆力、思维能力和社交能力。
1.2.3测量方法：
1.2.3.1智能测验：两组婴儿均于4至12月期间采用首都儿科研究所研发的“0～6岁小儿神经心理发育量表”。
1.2.3.2体格生长指标测量：12个月进行体重、身长、头围测量。
1.2.4 统计学方法 用SPSS统计软件统计分析，采用t检验，P
1.2.5 质量控制：两组婴儿均由一位经过正规培训、获得合格证书的医生，采用“0～6岁小儿神经心理发育量表”，进行婴儿智能发育测验。
2 结果
婴儿智能总发育商和各能区发育商的比较：两组婴儿总的发育商，实验组优于对照组，差异有统计学意义（P
3 讨论
3.1婴儿智能发育是先天遗传和后天环境因素相互作用不断积累的过程，婴儿智能发育的水平是由生物学因素、行为特征和家庭环境质量相互作用决定的。近年来脑科学的发展和婴儿心理学的研究进展，为早期综合发展奠定了生理和心理方面的理论依据。脑科学的研究表明，婴儿期是脑发育的一个关键期，在这一时期按心理发展年龄为婴儿提供丰富的各种感官刺激、语言环境、知觉辨别能力、适应能力及创造动手和身体大动作的机会，充分发掘大脑潜能，对婴儿的神经心理发育无疑具有推动作用。因此给予婴儿提供丰富的感官刺激、语言环境和适宜的认知能力、社会适应能力等锻炼，可促进婴儿的神经心理发育，使脑潜能得到充分的发挥，从而提高智力水平。
3.2 本研究两组婴儿在生物学和环境因素方面做了较严格的对照，条件基本相同。生物学因素方面：研究对象在出生后不久，通过详细询问病史和体检，符合正常足月新生儿标准，严格排除围产期高危因素。出生后到12个月经过密切随诊，未发现婴儿有中枢神经系统及其他重大疾病，体格发育主要指标均正常，因此两组婴儿基本上排除了生物学不良因素对智能的影响。而影响婴儿智能发育的主要因素，如性别、家庭结构大小、居住环境两组相仿均衡，因此两组智能结果是有可比性。本研究显示实验组的发育商比对照组高，差异有统计学意义，表明早期综合发展确实能促进婴儿智力发育，与国内其他研究结果一致[1，2]。
3.3 育儿存在的问题：部分家长存在错误的育儿观念：①捆绑肢体限制婴儿
活动，给婴儿戴手套，过多抱着婴儿，不敢让其有俯卧、翻身、坐爬等活动，束缚了婴儿探索世界的能力，限制其大运动及精细运动发展，也容易导致日后感觉综合失调；②长时间不洗澡、不洗头，使婴儿缺乏对水的触觉感，同时又引起生理上的不舒适感，导致婴儿产生爱哭、烦躁、不愿与人交流等情绪障碍。③缺少交流，将婴儿交给保姆、老人，以满足婴儿吃喝拉睡的基本需要为限，忽视亲子交流、情感的培养。早期综合发展是通过科学喂养，有目的的丰富环境教育活动来促进婴儿身心全面发育，根据婴儿发育特点，因势利导，开发各种能力，而不是有些家长片面理解的早期综合发展就是早教简单的让小孩早认字、读书。
3.4儿童的早期综合发展应该以社区为依托，充分发挥社区的资源优势。目前较多社区仍采用传统的4：2：1保健体检模式，这种模式内容僵化单一，提供的资讯极为有限，不能满足儿童实际的发展需要。家长对体格发育、智能评价与指导、亲子教育等服务内容的需求较高，而且也对婴儿抚触、亲子早教课堂等新兴的早期教育服务项目表现出很大兴趣。但是传统的社区儿童保健工作中并未涉及此类更为全面、更有针对性的服务项目，服务的内容与家长需求存在脱节。本研究通过早期综合发展模式，根据孩子的个体情况采取保教结合，并制定个体化成长计划，定期进行体格检查、神经心理发育测查与指导、婴儿体操等，并为家长开展育儿健康知识讲座和亲子游戏班，指导家长如何在家中使用益智玩具、亲子游戏等早期综合发展指导和干预方式。此模式可以因地制宜选取适合当地开展的内容在社区儿童保健工作中推广使用[3，4]。
参考文献：
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一、玉米花药培养研究概况
自1964年印度Guha等从茄科植物毛曼陀罗(Datura innoxia)的离体花药中成功诱导出单倍体植株以来，这一方法被广泛应用到28科68属170多种植物上。我国自1974年初首次成功诱导玉米花粉植株，1977年，广西玉米研究所与中国科学院植物研究所协作获得第一株纯合的玉米花粉自交果穗以来，曾一度掀起了玉米花培育种热潮，许多学者对影响玉米花培反应的各种因素如基因型、花粉发育时期、培养基等进行了大量研究，也获得了花培自交系并育成了杂交种应用于生产。如继谷明光等(1975)诱导出第一批玉米花粉植株之后,杭玲等(1991)先后培育出玉米花培杂交种桂三1号和桂花1号。桂三1号于1992年通过广西壮族自治区品种审定,这是国内外用花培方法育成的第一个玉米杂交种。杨宪民(1995)利用玉米花培纯系选育出优良杂交种花单1号。山东农业大学利用花培单倍体育种技术体系成功地选育出糯玉米杂交种山农花糯1号（王启柏，2002）。北京市植物细胞工程实验室玉米花培育种课题也取得了可喜的绩,获得了自交系种子（郭奕明，2001）。他们利用育成的玉米花培自交系配制的组合,抗病性强,杆粗穗大，抗倒伏。随着花药培养技术的发展，花培育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，发展成一套独特的育种技术体系。花培育种是生物技术在农作物育种应用最广泛、最有效的方法之一，在传统农业向高技术农业的转化中发挥着纽带作用，是一种快速有效的育种途径。
二、影响花药培养效率的主要因素
1.试验材料
1.1 供试材料的基因型
基因型是影响花药培养的主要因素之一。不同基因型的花药对培养的反应不同。杭玲等（1985）研究发现，接种不同材料，诱导率差异相当大。在接种的241份杂交组合中，诱导出愈伤组织的材料为212份，占总接种材料的88%，各种材料的诱导率差异幅度为0.02%-100%。何雪银等（2004）对14份糯玉米材料的花培反应率进行离体培养，有13份材料具有花培反应，占参试材料的92.85%，出愈率在3.16~0.06%；对10份优质蛋白玉米材料的花培反应率进行离体培养，有5份具有花培反应，占参试材料的50%，出愈率在0.65~0.11%。这说明在基因组内,可能存在着可调控小孢子发育的基因。
1.2 供试材料的生理状态
供试材料的生理状态、植株年龄、植株健壮程度、植株生长发育的生态环境（光照、温度、大气湿度）等各方面的因素会直接影响到愈伤组织的形成。谷明光等（1988）认为，取样日期不同，诱导物产生频率差异很大。曹孜义等还认为，即使同一天取样时间不同，诱导率都不同。郭奕明等发现，生长在大田和温室中以及在不同季节里的玉米，在培养过程中诱导频率都有很大差异，所以应尽量使供体植物的种植标准化。根据一般经验，在适宜条件下生长的健康植株，其花药和花粉培养的胚诱导率和植株再生率高。从季节上看，冬春季较夏秋季更适合进行花药培养，这可能是温度与光周期共同作用的结果。
1.3 花粉发育时期的影响
花粉发育时期是诱导小孢子分裂的关键时期。只有花粉发育到一定时期的花药,才对外界刺激敏感。而不同植物的花粉对外界刺激的敏感时期是不同的,如水稻、烟草的花粉,从单核中期到双核期皆可接受诱导,而玉米的花粉,以单核中后期为佳。此时的玉米花药长度约4mm,颜色呈淡绿色。
2.培养基成分的影响
2.1基本培养基
基本培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件，培养基对花药培养的成败影响很大。在玉米花培的早期,中国科学家对各种基本培养基配方进行了评估(Chu,1981;Ku,1981)。此后,N6、玉培、正14等培养基在玉米中都经常用,效果也差不多。1982年，杭玲等用正交试验方法对培养基的大量元素进行调整试验，筛选出“82-1”培养基，与N6、正14、玉培等培养基相比，他们认为“82-1”培养基比较适合玉米花药产生愈伤组织，能使80%的参试材料产生愈伤组织或胚状体。杭玲还指出，“82-1”培养基还不是最理想的培养基，要选择出能广泛适于各种基因型材料产生更多的愈伤组织或胚状体的培养基，仍需继续做更多试验。
2.2 培养基的附加物质
2.2.1植物激素 在花药培养中,调节激素成分不但可影响花粉发育类型,而且还可以影响到二倍体的体细胞组织生长增殖。各种研究表明,生长素(特别是2,4-D)和细胞分裂素(特别是KT或BA)的适当比例,能促进孢子体的小孢子发育。一般诱导培养基用生长素的适宜浓度为2mg/L,而分化培养基用生长素的适宜浓度为0.5mg/L。
2.2.2氨基酸 在培养基中加入适量的氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸、L-羟脯氨酸，L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸，可以促进愈伤组织和胚状体的发生。
2.2.3 糖 糖作为培养基中的主要碳源，它不单是调节渗透压，对花粉脱分化和再分化产生有利效应。有研究报道，蔗糖浓度在12~15%是花粉脱分化培养基最好浓度，再分化的培养基的蔗糖浓度在5~6%较适宜（王子霞，2001）。
3.预处理的影响
日前，低温预处理已成为一项广为采用的提高花药诱导率的措施。低温处理时间视使用的温度而定。较低的温度处理时间短，较高的温度处理时间长。典型的玉米花药处理时间为4~14℃处理7~14d(Nitsch等,1982;Genovesi和Collins,1982;Dieu和Beck2ert,1986,Tsay等,1986)。
4.培养条件
4.1光照
离体花药对光照的反应是不同的。一般认为,花药培养在诱导愈伤组织进行暗培养或给以散射光处理比较好。在分化培养期间，在光强为2000Lx，每天光照10个小时为宜。
4.2温度
培养条件中最主要的是温度。离体花药对温度比较敏感,是诱导小孢子发育的关键因素。研究表明，诱导培养适宜的温度范围在25~28℃，分化培养的适宜温度范围在23~26℃。
4.3接种密度
由于花药在培养基上存在营养竞争关系,呼吸代谢等相互作用,因此，接种密度直接影响愈伤组织的诱导频率和发育。玉米花药培养中，每支试管接种30~50枚花药的接种密度较为合适。
三、花药培养在育种中应用
1.种质材料创新
利用花药培养可以克服远缘杂交的困难。远缘杂交作为一种育种手段，能引入不同种、属的有用基因，为改良现有品种提供了一条重要的途径。然而在远缘杂交过程中，却存在着杂交不易成功、杂种一代不育或育性低和杂种后代性状分离幅度大或“疯狂”分离，时间长，不易稳定三大困难。通过花药培养，虽然不能解决上述第一困难，但能克服第二、第三种困难。在远缘杂种的花粉中也有少数有发育能力，或者早期是正常的，这可以通过花药培养，获得花粉植株，克服上述二者困难。
2.在诱变育种中的应用
花药培养在诱变育种研究中具有特殊的作用。细胞诱变筛选育种无疑为育种家提供了一条较为便捷的育种途径。利用体细胞进行诱变筛选，由于体细胞中染色体成对存在，要想使发生了突变的基因尽快纯合并表现出来，还需要经过一些自交过程，而利用花药培养则可以加快诱变突变体的表现进程。如胡忠等、庄承纪等对水稻离体花药及其花粉植株进行化学诱变或辐射诱变,获得了早熟、矮杆突变系。花药培养中获得变异体的频率较高,目前在应用各种选择压进行诱变并筛选抗寒、抗盐碱等变异系方面, 都有良好的进展。如郑祖玲等用稻瘟病病原菌粗提毒素作为选择压,将不抗稻瘟病的水稻品种花寒早、桂农12等的花药,接种在有稻瘟病生理小种F1、E3粗毒素的培养基上培养,获得了能抗这2个稻瘟病生理小种的花粉植株株系;Faedi等在培养Pajaro品种的草莓花药时发现,再生植株中存在无性系变异,所获得的1484株植株中,36株表现高产、大果和低感病性。
3.在抗病育种中的应用
花药培养和抗病育种紧密结合,导入抗病基因,是培育抗病品种的有效方法之一。由于二倍体花粉植株来源于单倍体,控制病害抗性的基因已经纯合,抗、感病特性十分明显,因而就能很快地将符合育种目标的抗病株系挑选出来,从而育成抗病品种。聂道泰等在中间偃麦草与小麦杂交的衍生材料中发现“中5”具有中间偃麦草的高抗黄矮病和对条锈病免疫的性状,因而以“中5”为外源抗性基因供体,通过花药培养,快速创制出稳定的小麦条锈病和黄矮病抗性新种质；野生稻ST221抗稻瘟病、感白叶枯病,RBB16则抗白叶枯病、感稻瘟病,而普通栽培稻对2种病都不抗,庞汉华等通过栽培稻与野生稻杂交、花粉植株培养,培育出综合了野生稻亲本抗性的野栽稻杂交后代。应用同样的方法,还可将其它的抗性基因导入到优良品种中去。
4.在转基因育种中的应用
将目的基因转入单倍体材料,更容易鉴定和筛选具有外源基因的材料。小孢子作为外源基因的受体,可以通过离体培养直接获得纯合的转基因材料,使目的基因易于表达。与常规育种、分子育种相结合,拓宽花培育种的应用领域。把分子标记辅助育种与花培技术紧密结合起来,既可以显著提高培养效率,快速纯合植物基因型,尽快获得纯合转基因植物,同时也扩大了花培技术的应用范畴。
四、存在问题
植物花药培养研究取得了很大进展,但是在实际应用和扩大花药培养的基因型范围方面,还有许多工作要做。
1.诱导频率和分化成苗率低
对于多数植物来讲,能形成有活力胚的花药百分率很低。通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象,或刚开始生长便导致胚败育,大量畸形胚状体出现,愈伤组织分化能力低,白化苗难以避免，因此，难以获得足够的选择群体而严重限制了该技术在育种实践中的应用。因此,大幅度提高玉米花药培养效率,获得大量的加倍纯系,是目前玉米花药培养育种中急需解决的问题。
2.培养方法没有达到普遍的最优化
培养基成分及培养条件间相互作用关系不清楚，胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率较低，不定芽生长能力差，结果造成成苗率低，植物再生周期长，白化苗增多等，这些尚有待进一步深入研究，以建立玉米花药培养的最适体系。
3.花药培养易受到体细胞的干扰
在花药培养过程中，花药壁、绒毡层组织会不可避免地通过愈伤组织阶段形成胚状体。目前主要通过提高蔗糖浓度，减少或不用2，4-D来诱导花粉愈伤组织，而采用NAA和6-BA配合使用来避免体细胞对花药培养的干扰，但对一些植物种类效果不明显，没有从根本上解决问题，这给染色体倍性鉴定带来了麻烦，所以如何有效的控制体细胞干扰，需要进一步的研究。
总之，花药培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段之一，加强花药培养体系中关键技术和遗传机理的研究，使花药培养与基因工程相结合，解决花药培养对基因的依赖性，提高花药培养效率，将为花药培养的应用开创一个新的局面。
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关键词：高级微生物学；硕士研究生；教学改革
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）01-0154-02
研究生的培养不同于本科生，按教育部下发的《关于深化研究生教育改革的意见》（教研1号）所说，培养高层次人才的主要途径是研究生教育，它是国家创新体系的重要组成部分。该意见要求在研究生学习阶段，课程学习和科学研究要有机结合，强化培养学生的创新能力。高级微生物学是生物科学与工程学院生物工程专业学位研究生和微生物学学术型研究生必修的一门课程，是微生物学理论和实践相结合的一门课程，在研究生的课程中，具有举足轻重的作用。随着现代生物技术的飞速发展，新理论、新材料、新方法、新技术的不断推广应用，《高级微生物学》课程的教学内容也逐步变化，旧的理论、实验设备及实验方法有些已淘汰，新的已经补充。为了使研究生及时了解本学科国内外的发展现状与动态，提高其从事科学研究、教学与科技管理、指导生产实践的能力，本教学团队在多年的教学基础上，对研究生的“高级微生物学”课程进行了改革探索。主要针对教学内容、教学方法、考核方式等方面进行了改革，努力提高教学质量，积极培养研究生的创新能力。
一、修订教学大纲，优化教学内容
江西农业大学1957年创建了微生物学科，国内知名学者黄其望、欧阳谅等老前辈创建本学科。半个多世纪历经几代人的辛勤耕耘，微生物学科得以发展壮大。2003年本学科经教育部批准为硕士点，开始招收微生物学专业硕士研究生，而“高级微生物学”一直被列为微生物学专业硕士研究生的一门重要专业核心课程，该课程没有固定教材，讲授相关领域的最新研究进展是主要的教学内容，同时设定一定学时的讨论课。随着研究生扩招，研究生掌握的微生物学基础知识参差不齐。为了使研究生的微生物学基础知识得以强化，为了拓宽研究生的知识背景，“高级微生物学”课程以周德庆主编的“微生物学教程”和沈萍主编的“微生物学”为主要教材，教师讲授部分内容，学生自学部分内容。
根据学科发展和进步及时修订和完善教学大纲，新的教学内容分几个部分：
（1）简要介绍微生物学发展史，微生物研究与发展现状，巩固本科学习阶段的内容，夯实研究生学习高级微生物学的基础；
（2）根据微生物的特点，沿着微生物的形态结构、生长发育、新陈代谢、代谢调控等基本理论主线，阐述微生物资源开发利用和学科的最新成就；
（3）围绕微生物学基本技术和最新的技术方法，从微生物生态学研究与应用实践，微生物的分类与鉴定两方面讲解。
教师在授课过程中，要尽量结合科研和生产的实例，阐明微生物学现代技术方法、原理和应用，使学生掌握科学研究应具备的科研思路和常用的微生物学技术，引导学生在科研设计和实验中去提出问题，分析问题和解决问题。教师在结合国内外微生物学科的一级期刊以及Science、Nature等杂志上新近发表的微生物学相关研究成果授课过程中，让学生了解微生物学领域中的源头创新及科学效应，及时更新教学内容，使教学内容与时展保持同步。
二、改革教学方法，培养学生创新能力
大多数研究生认为研究生学习期间关键是要把实验做好，课程的学习不重要，学习目的不明确，学习态度不积极，所以经常有大量的学生缺课。有的研究生为了获取学分，不是深入探索学习相关知识，而是通过考试前死记硬背一些考试内容过关。如果老师要求写文献综述，很多学生为了完成任务，就在网上收集一些论文资料，不做任何分析，敷衍了事。研究生教育要求学生不但知识背景要宽泛，而且要有扎实的基础理论和专业知识，要达到这种目的必须是通过课堂教学而不是通过实验完成。因此我们试图改变教学方法，提高学生学习兴趣。我们将理论教学分解为精讲部分、讲座部分、自学讨论三个部分。把以教师为中心变为以学生为主体，充分发挥教师的引导作用和学生的主观能动作用。首先布置课前文献报告，再组织课堂交流，讨论文献相关问题，最后监督讨论后的研究报告和进程，把知识灌输改变为以重视能力培养为目的的传授知识。通过探究式、激发式教学方式，提高教学水平，培养研究生创新能力和创新意识。
三、开展专题演讲，锻炼学生综合能力
完成理论基础知识的讲解部分内容后，给每个学生设立一个主题，如重金属的微生物代谢研究进展、微生物来源天然产物的生物合成和组合生物合成、微生物代谢组学、细菌的信息交流、环境微生物基因组学、土壤微生物生态工程、微生物蛋白组学、未能培养微生物、新基因发掘和功能研究、农用抗生素的研究等，要求学生结合自己将来的研究工作进行选题。学生可利用互联网、图书馆查阅文献资料综合分析，写成5000字左右的综述（不含参考文献），制作PPT，安排一定的课时要求学生轮流上台演讲，其他学生和老师作为评委，根据其幻灯片制作是否精美、语言表达是否流畅、内容是否条理清晰、回答问题是否恰当等指标为演讲的同学综合评分。研究生通过这些新知识的学习，开阔了的学习视野，启发了思维，强化了学术研讨和文献调研的能力，奠定了科研课题研究工作的基础。
四、增设实验环节，增强学生实践能力
由于招生规模逐年扩大，研究生生源多样化明显。不同的生源掌握的微生物学实验技术差别明显，新生现状给研究生教学提出了新的挑战。由于是第一学期开设高级微生物学课程，很多学生尚未进入实验室，为了培养研究生严谨的治学态度和持之以恒的科学精神。我们在课程改革中增设了实验环节。在实验安排中，首先设计的是一些基础性的实验，如，土壤中好氧微生物的分离、纯化及无菌操作技术；细菌与酵母、放线菌与霉菌的菌落特征识别；普通光学显微镜的使用与放线菌染色技术及其形态和结构观察。随后根据学生将来的研究方向选题，设计实验方案，在老师指导下开展实验。例如微生物次级代谢产物研究方向的研究生，我们确定的题目是“放线菌发酵培养物对土壤及植株养分的影响”通过实验了解不同浓度的链霉菌代谢产物处理水稻种子，对种子萌发率、可溶性糖、叶绿素含量及根系活力的变化进行综合分析；以稻瘟病菌为病原菌对三叶一心期的水稻进行处理，以观察链霉菌对水稻幼苗抗病效应的影响。通过这个创新实验环节，一方面提高了不同生源学生的实验操作技能，另一方面培养了学生的学习主动性，同时，学生的团队协作精神也得到了提升。
五、规范考核模式，强化基础知识，考查思维创新
研究生课程考核模式主要有三种，提交课程论文、开卷考试和闭卷考试等。但这些考核方式均存在弊端，如课程论文，学生只是在网上拷贝现有的论文，不做任何的归纳总结。开卷考试则是学生把试卷拿回去，在网上搜索相关答案直接照搬照抄。闭卷考试时，学生就在考试前突击，死记硬背。总结经验，我们对高级微生物课程成绩的最终评定做了许多调整，量化各项指标。我们将考核内容设定为考勤5%+课堂交流25%+课外作业15%+期末考试55%，考勤考查的是到课率，课堂交流包括课堂问题的交流和由学生选定的专题演讲，课外作业为布置的每章节的作业，期末考试主要是讨论型的题型。增加平时成绩和讨论分析题型的比例，可以有效避免学生考前突击，考后就忘的现象，引导学生真正地用脑学习。
为了顺应现代生物技术的飞速发展，教师不仅要有宽泛的生命科学理论知识，而且其技术知识层次也要跟上现代生物实验技术不断更新的步伐。因此我们在研究生的高级微生物学教学过程中，随时关注高水平期刊文献，更新补充知识，及时引导学生密切关注最新的研究。教师从学习者实践体会方面得到宝贵信息和教学资源，促进了知识结构的不断更新，提高了教学水平，有效地实现了教学相长。
国内许多生物相关专业院校都开设了《高级微生物学》课程，各院校在教学内容组织、教学方法和手段、学生实践等方面各有所长，有许多值得我们学习和参考的做法。例如南京农业大学充分利用英文原版教材提供的课程网站、各类多媒体技术等教学手段，提高教学信息质量，关注前沿动态和最新科研成果，采用双语教学试点部分教学内容、建立网络交流平台的做法值得我们学习。当然在进行课程改革的过程中，会遇到一些问题，如在安排课程实验时，需要课时的保证和实验场地，由此影响了原来的教学安排，这就需要协调实验室和师资安排。我们将进一步探讨课程改革的可行性，尽可能地完善高级微生物课程教学模式，促进研究生研究性、自主性学习，完善知识背景和提升研究能力。
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关键词：妊娠高血压疾病 发病学 研究进展
中图分类号：R711 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）10-0222-03
母亲安全、儿童优先是围生医学永恒的主题。该主题的初级目标是降低孕产妇和围生儿死亡率，中期目标是降低母婴发病率和残疾率，终期目标是提高人口素质[1]。
妊娠期高血压疾病的发病学及机制的不清目前仍然困扰着全球产科。由该病引起的孕产妇及围生儿的死亡率和并发症也一直威胁着女性健康。由于现代实验方法的进步，在研究过程中发现了很多与妊娠高血压疾病的发生、发展相关的因子，从而建立了许多学说，本文从以下几个方面来综述：
1 发病学研究的概述
尽管妊娠高血压疾病的病因研究已有100多年的历史，通过无数学者不懈的努力但至今仍未很清楚的阐明。其病理生理学改变广泛而复杂，包括全身血管痉挛、凝血系统的激活及止血机制异常，前列环素与血栓素比值的改变等。这些异常的改变导致多器官系统血管的病理损害（如肾、肝、心、脑及子宫胎盘血管床），结果可引起胎儿生长迟缓、死胎、早产、围产期窒息，孕妇也容易并发胎盘早剥、抽搐、颅内出血、肺水肿及肝肾功能衰竭等。近年来，随着医学基础理论特别是分子生物学的研究进展，使妊娠高血压疾病从发病学的研究到病理生理变化取得了新的突破。
2 发病学研究的机制与学说
2.1胎盘或滋养叶细胞缺血学说：
早在1918年，Young首先提出子宫缺血学说，其支持理由在于妊娠高血压疾病多发生于：（1）子宫内压增高的患者；（2）合并有全身血管病变的孕妇；（3）先天性动脉发育畸形的患者。以后通过许多学者的实验证明，子宫—胎盘缺血学说获得公认。后来又从葡萄胎可并发妊娠高血压疾病的现实得到启示，胎盘缺血关键可能在于滋养叶细胞缺血。
滋养叶细胞缺血与早孕期子宫胎盘血管床发育受阻有关。提示早孕期滋养叶细胞缺氧，可能是导致子宫胎盘血管床发育受阻的重要原因。目前又称这种病理现象为胎盘浅表着床或缺陷胎盘。
2.2高同型半胱氨酸血症与血管内皮损伤学说：
近年来，动物试验证实，高同型半胱氨酸血症可诱发孕鼠产生妊娠期高血压疾病的典型改变[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血压疾病发病学研究的热点。高同型半胱氨酸可能导致妊娠期高血压疾病的机制：高同型半胱氨酸促进氧自由基的生成，使氧化还原系统平衡失调，呈现氧化应激状态，导致血管内皮细胞受损，继而引发小动脉痉挛等一系列病理生理改变，符合妊娠期高血压疾病的发病机制[3]，动物试验通过给予蛋氨酸负荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸动物模型显示，血浆一氧化氮浓度较试验前明显降低，证实了高同型半胱氨酸血症对血管内皮功能的损害作用[4]。高浓度的同型半胱氨酸及其产生的过氧化物超过了细胞的清除能力，破环了细胞的防御性保护反应,导致内皮细胞损伤。实验研究发现高同型半胱氨酸血管内皮损伤的特殊标志物：血管内皮损伤因子[5]，血管细胞粘附因子21，纤维结合素[6]，均生成增加[7]。研究还表明，早发型重度子痫前期患者血清同型半胱氨酸显著高于晚发型重度子痫前期组及正常妊娠组[8]。所以，研究证明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血压疾病内皮细胞损伤中起着很重要的作用。目前认为，血管内皮具有多种重要的生理功能。一旦血管内皮受损可导致血管通透性增加，体液与旦白升高，抗凝血因子和血管扩张因子减少，在受损部位引发促凝血因子合成和激活凝血系统，最终导致血小板凝聚及血栓形成并释放有丝分裂元，其中主要的有血小板衍生生长因子，这是一种很强的血管收缩因子。因此，血管内皮损伤是目前提出普遍公认的妊娠高血压疾病的主要发病机理。
2.3免疫学说：
从免疫学角度看来，胚胎是一半同种异体移植物，妊娠成功有赖于胎儿——母亲间的免疫平衡，而这种平衡一旦失调，就可能引发排斥反应，导致病理妊娠，如妊娠高血压疾病。目前支持妊娠高血压疾病与排斥反应有关的证据主要是，患者子宫螺旋小动脉存在着类似于肾移植排斥反应所出现的典型的血管炎病变，即螺旋小动脉急性粥样硬化。这一点为过去和近年来国内外研究反复证实。
2.4遗传学说：
从临床观察，妊娠高血压疾病存在着明显的遗传倾向，即有妊娠高血压疾病家族史的孕妇，妊娠高血压疾病发病率明显高于无家族史的孕妇。
从分子学水平对本病进行探讨发现，采用血清学方法检测，妊娠高血压疾病患者白细胞抗原（HRA）DR4频率明显增高。PCR和地高辛标记寡核苷酸探针杂交技术，探查H41—DRB1基因座位，也证实妊娠高血压疾病HLA—DR4抗原频率增高和母亲、胎儿HLA—DR4抗原相容性增加有关，同时还发现等位基因0405基因频率也明显增加。这些表明，妊娠高血压疾病至少与HLA—DR4相关。妊娠高血压疾病分子遗传学的研究，还有待深入。
[关键词] 半夏曲； 发酵； 优势菌种； 16S rDNA和26S rDNA； 系统发育树； 菌种鉴定
半夏曲是临床上常用的中药炮制品之一，为清半夏、六神曲、生姜汁、面粉、白矾发酵而成。半夏曲含有酵素等， 具有祛湿化痰、降逆止呕、健脾温胃的功能， 用于治疗心下痞满， 不欲饮食， 倦怠乏力， 大便不调[1]。半夏曲的现代研究侧重处方筛选、化学成分等，对于半夏曲炮制中起重要作用的微生物研究甚少。目前，仅蔡清宇等[2]初步表明生半夏曲中含较多杂菌，在血平板培养基中培养出革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌及球菌，在沙氏培养基中未培养出真菌。本实验对半夏曲发酵炮制过程中不同时间点的微生物菌群种类和数量变化进行初步研究，并分离鉴定优势菌种，研究结果将为揭示半夏曲炮制机制奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
MILLIQ超纯水仪（美国Millipore公司）；培养箱（上海一恒科技有限公司）；PTC200 PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪（美国伯乐公司）；I16K高速低温离心机 （Sigma公司）。
1.2 试剂
硫酸链霉素、琼脂粉、溶菌酶购自北京索莱宝；脑心浸液肉汤培养基、马铃薯葡糖糖琼脂购自青岛海博，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（自配）；植物基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、酵母菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR master Mix购自北京天根；溶菌酶缓冲液、PCR引物购自上海生工；琼脂糖购自Innvitrogen公司；DM2000 Marker购自康为世纪公司。
1.3 供试样品
半夏曲炮制过程中不同时间点样品由成都中医药大学提供。
1.4 引物
细菌16S rDNA基因通用引物序列，27F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。真菌26S rDNA基因通用引物序列[3]，NL1： 5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G3′；NL4： 5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2 方法
2.1 半夏曲的制备（由成都中医药大学制备）
参照中药部颁标准。清半夏 160 g、白矾 10 g、 六神曲 5 g、生姜汁20 g、面粉 32 g，除生姜汁、面粉外，其余3味粉成细粉；生姜汁加水适量，与面粉及上述细粉搅匀，制成粗粒软硬适宜的小块或颗粒，发酵，干燥。分别取发酵0，18，36，54，72 h的样品于无菌的密封袋中4 ℃保存，并在3 d内完成不同种微生物的培养计数。
2.2 微生物的培养及菌落计数
取5个炮制时间点的样品各1 g于无菌的小锥形瓶中，加入9 mL的无菌生理盐水在水平摇床摇匀，取配好的样液1 mL加入9 mL的无菌生理盐水，依次进行梯度稀释为1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，根据不同取样点的样品菌落数选取合适的3个稀释梯度（1×10-1，1×10-2，1×10-3）。取100 μL稀释液注入平皿固体培养基上，用涂布器涂布均匀，每个稀释度做3个重复。细菌培养皿置于37 ℃培养箱培养1～2 d。霉菌和酵母菌培养皿置于28 ℃培养箱培养3～4 d。菌落的计数公式：每1 mL原菌液活菌数=同一稀释度3个平皿菌落平均数×稀释倍数×10。
2.3 优势菌种的分离纯化
挑选各样品培养皿中的细菌、霉菌、酵母菌菌落，取菌落形态相似且出现频率多的微生物作为优势菌种进行分离纯化（尽可能多挑出形态不同的菌落）及形态学观察。将纯化后的单一菌落置于无菌EP管中保藏于4 ℃ 冰箱并尽快进行分子生物学的鉴定。
2.4 优势菌种的鉴定
2.4.1 优势细菌的鉴定 将保存的优势细菌传代培养，刮取菌苔用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，采用细菌16SrDNA的通用引物27F/1492R进行扩增。PCR反应体系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，补充ddH2O至25 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 s，30个循环；72 ℃ 10 min。取2 μL的扩增产物在1%的琼脂糖上进行凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶拍照系统检测扩增产物。将扩增产物送至上海生工进行测序。测序结果使用Biodit软件打开，将测序结果复制于NCBI网站上使用Blast进行同源性比较，下载同源性较高的序列采用MEGA 4.0软件的NeighborJoining方法，1 000 次 Bootstrap检验后构建系统发育树。
2.4.2 优势真菌的鉴定 将保存的优势真菌菌株传代培养，刮取菌苔，分别用酵母菌基因组DNA、植物基因组DNA提取试剂盒提取不同发酵时间点的优势酵母菌和霉菌的DNA，采用真菌26S rDNA的通用引物NL1/NL4进行扩增。PCR反应体系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，补充ddH2O至25 μL。反应程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。其他同2.4.1。
3 结果与分析
3.1 半夏曲发酵过程中微生物种类、数量变化及优势菌种形态学观察
在半夏曲炮制过程中，从发酵0 h至发酵72 h，细菌数量少且呈缓慢增长趋势；酵母菌在发酵前期数量偏少且变化不明显，发酵至54 h时数量急剧增加，至发酵结束时达1×107.78 CFU・mL-1，在发酵前期并未出现霉菌，然而发酵至54 h时霉菌数量迅速升高1×106.91 CFU・mL-1，至发酵结束时与酵母菌数量相差无几（表1，图1）。5个不同发酵时间点样品共挑选出27株优势菌，其中细菌11株，酵母菌9株，霉菌7株，菌落颜色为白色和黄色，对优势细菌进行形态学观察及革兰氏染色，大多为革兰氏阳性杆菌；对优势酵母菌镜检可观察到明显的出芽，对优势霉菌镜检可观察到菌丝和孢子。
3.2 优势菌种的分子生物学鉴定
从半夏曲发酵过程中的5个不同时间点共分出27株优势菌株，采用16S rDNA，26S rDNA序列分析、相似性比对及构建系统发育树分别对优势细菌、真菌进行鉴定。AaX1为Streptomyces sp.（链霉属）；AaX2为Staphylococcus epidermidis（表皮葡萄球菌）；AaX3，DdX2为Bacillus pumilus（短小芽孢杆菌）；AaX4，BbX2，BbX4，EeX1为Bacillus sp.（芽孢杆菌属）；BbX1，DdX1为B. subtilis（枯草芽孢杆菌）；BbX3为B. aryabhattai（阿氏芽孢杆菌）。AaJ1，AaJ2，AaJ3，BbJ1，BbJ2，DdJ1，DdJ2，DdJ3，DdJ4为Meyerozyma guilliermondii（季也蒙毕赤酵母菌）；375J，375M为Paecilomyces variotii（宛氏拟青霉）；3100J，3100M为Byssochlamys spectabilis（丝衣霉菌）；EeX2，FfX1，FfX3为Aspergillus niger（黑曲霉）（表2，图2，3）。
4 讨论
目前关于半夏曲发酵过程中的微生物研究极少，对于菌种的鉴定也只是粗略的归类。本文首次研究半夏曲发酵过程中不同时间点的微生物种类和数量变化及其优势菌种进行分子生物学鉴定。研究发现半夏曲发酵过程中细菌数量少、变化平缓，而酵母菌和霉菌数量发酵至54 h时迅速增加，至发酵结束时达1×107 CFU・mL-1以上；优势菌株的鉴定为优势细菌Streptomyces sp.，B. pumilus，B. subtilis，B. aryabhattai以及其他的Bacillus sp.，优势酵母菌M. guilliermondii，优势霉菌P. variotii， B. spectabilis， A. niger。结合菌落计数与分子生物学鉴定结果，推测发酵54， 72 h时酵母菌的选择性培养皿上分离出的是霉菌，可能在发酵前期酵母菌利用面粉中的淀粉质迅速繁殖，中后期淀粉质减少酵母菌的数量也逐渐减少。
霉菌在发酵中能产生各种蛋白质酶以及α淀粉酶，A.niger还能产酸性脂肪酶和有机酸[45]。A.niger，M.guilliermondii能产生菊粉酶，菊粉酶是一种微生物酶。现在已知的能产菊粉酶的微生物主要有A.niger，A.ficuum，A.Phoenicis，Pichia sp.，Debaryomyces cantarellii，Athrobacter sp.，Clostridium acetobutylicum[67]。菊粉酶的水解产物低聚果糖是双歧杆菌的增殖因子，它能抑制有害菌的增长，调节胃肠道的功能；降低胆固醇和血脂，改善脂质的代谢，促进矿物质的吸收以及纤维素的合成等[8]。P.variotii能产木聚糖酶，木聚糖酶能促进蛋白酶、淀粉酶等水解酶的释放，提高发酵效率，广泛用于酒类的酿造[910]。Bacillus sp.具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，它能产生纤维素酶将半夏曲中的植物类原料细胞的细胞壁破坏，促使细胞中的营养物质释放出来。B.spectabilis在发酵中的相关研究较少，对于其具体的酶学性质还有待进一步的研究。将半夏曲与生半夏、法半夏、姜半夏比较时发现只有半夏曲具有消食化积的作用，这可能与半夏曲发酵过程中微生物产生的蛋白质酶、淀粉酶、脂肪酶、菊粉酶等有关。本研究首次对传统曲类中药半夏曲不同发酵时间点的优势菌株进行了分离鉴定，为揭示半夏曲的炮制机制奠定了基础。
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